周洋枝，蘇蒙蒙，路 棟，時(shí) 杰，高玉榮

（巢湖學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，安徽合肥 238000）

硒作為一種抗氧化劑，參與阻斷體內(nèi)自由基反應(yīng)，避免胰島β 細(xì)胞被氧化破壞，維持其正常功能運(yùn)行，可降低尿糖和血糖，促進(jìn)人體內(nèi)糖分代謝[1]。研究發(fā)現(xiàn)，癌癥發(fā)生與血硒水平的高低有著密不可分的關(guān)系，硒可調(diào)節(jié)人體對(duì)維生素吸收和相關(guān)酶的合成，可抑制致癌物?，F(xiàn)如今研究主要集中在通過生物體內(nèi)轉(zhuǎn)化有機(jī)硒，用于開發(fā)功能性富硒食品和臨床預(yù)防及治療相關(guān)疾病，而酵母是有機(jī)硒富集最佳載體，富硒酵母可食用安全性和生理活性高，且生產(chǎn)周期相對(duì)較短，對(duì)人體或動(dòng)物體內(nèi)的血硒水平有改善作用，若能實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，可以改善我國(guó)食品缺硒現(xiàn)狀，帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

1 用于富硒的微生物類型

可用于富硒的微生物研究較多的主要是酵母和食用菌。用于富硒的酵母主要有釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、魯氏酵母（Saccharomycesrouxii）、葡萄汁酵母（Saccharomyces uvarum）、紅發(fā)夫酵母（Phaffiarhodozyma）、漢遜酵母（Hansenula） 屬、球擬酵母（Troulopsis） 屬和假絲酵母（Candida） 屬等的酵母。用于富硒的食用菌主要包括金針菇、香菇、平菇、靈芝等。

酵母在無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化有機(jī)硒方面有很大的優(yōu)勢(shì)，為了達(dá)到更好的富硒效果，一般要進(jìn)行菌種誘變改良，獲得高產(chǎn)菌株。鄒艷等人[2]先對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母Ⅰ、產(chǎn)朊假絲酵母Ⅱ、熱帶假絲酵母、魯氏酵母、球擬酵母5 種菌種進(jìn)行富硒能力比較，經(jīng)耐硒馴化篩選出產(chǎn)朊假絲酵母Ⅰ，再進(jìn)行化學(xué)-紫外復(fù)合誘變?cè)囼?yàn)，得到U-16 菌株，最終有機(jī)硒含量高達(dá)95.26%，篩選出性能穩(wěn)定的菌種可用于富硒產(chǎn)品研制，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化，但是篩選過程較繁瑣。酵母菌中的紅發(fā)夫酵母營(yíng)養(yǎng)成分豐富，含有抗氧化性的蝦青素[3]、維生素和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，因此對(duì)紅發(fā)夫酵母進(jìn)行富硒培養(yǎng)將成為研究熱點(diǎn)。徐洲等人[4]通過對(duì)紅發(fā)夫酵母的硒添加量、培養(yǎng)時(shí)間、裝液量的研究，確定了培養(yǎng)的最適條件，此時(shí)有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率可達(dá)63.2%。

多形漢遜酵母具有高效、低成本的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)今后有機(jī)硒制備和還原型谷胱甘肽制備具有重要應(yīng)用意義。錢衛(wèi)東等人[5]就富硒- GSH 多形漢遜酵母的發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)的試驗(yàn)分析，在最適發(fā)酵條件下，多形漢遜酵母的無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化率為90%以上。

現(xiàn)在普遍研究的是釀酒酵母富硒，劉杰等人[6]在不同糖度麥芽汁培養(yǎng)基上培養(yǎng)啤酒酵母，經(jīng)過對(duì)比各自菌種生長(zhǎng)情況，確定2 °Bx 的麥汁培養(yǎng)基，但研究結(jié)果指出酵母得率與報(bào)道數(shù)據(jù)有較大差距，故在原有培養(yǎng)基基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，發(fā)現(xiàn)適量加入酵母提取物、葡萄糖、硫酸銨和磷酸二氫鉀，分別不同程度地提高了酵母的生物量，但葡萄糖、硫酸銨同時(shí)過量加入對(duì)酵母生物量的提高有抑制作用。機(jī)制目前尚未定論，可能與酵母胞內(nèi)酶和蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)有關(guān)。

2 酵母富硒的培養(yǎng)基

從酵母細(xì)胞的組成成分來看，酵母生長(zhǎng)對(duì)于碳、氮、磷元素的需求很高，一般認(rèn)為麥芽汁培養(yǎng)基和YPD 培養(yǎng)基是較理想的富硒酵母培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基的選擇上，大多數(shù)使用合成培養(yǎng)基，主要為了滿足酵母對(duì)微量元素的需求。朱威等人[7]在對(duì)啤酒酵母富硒培養(yǎng)時(shí)采用培養(yǎng)基配方為蛋白胨1.5%，葡萄糖4.0%，牛肉膏2.0%，磷酸氫二鉀1.0%，硫酸銨0.5%，pH 值6.0。

曾東等人[8]分別采用YEPD 液體培養(yǎng)基（1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖） 和PDA 培養(yǎng)基（蔗糖2%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，硫酸鎂0.05%，瓊脂2%，生長(zhǎng)因子0.5%，pH 值5.0） 培養(yǎng)富硒酵母，結(jié)果表明相同條件下YEPD 培養(yǎng)基培養(yǎng)后菌體的有機(jī)硒轉(zhuǎn)化程度遠(yuǎn)低于PDA 培養(yǎng)基，而YEPD 培養(yǎng)基在菌種生物量的積累上有優(yōu)勢(shì)，說明PDA 培養(yǎng)基更有利于硒的富集，而在YEPD 培養(yǎng)基啤酒酵母生長(zhǎng)代謝旺盛。這種合成培養(yǎng)基雖然能滿足酵母的生長(zhǎng)，但是原料成分較復(fù)雜、來源有限、成本相對(duì)較高，不適合投入大量生產(chǎn)。

范秀英等人[9]采用蔗糖糖蜜為主要培養(yǎng)基，再加入（NH4）2SO40.5%, H3PO40.1%，蔗糖糖蜜天然原料的使用在一定程度上降低了成本，而且指出利用原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建成的菌株ZFF-28 在60 μg/mL硒質(zhì)量濃度培養(yǎng)基中，生物量和硒含量均達(dá)到較高水平。

印宏緋等人[10]采用多種農(nóng)副產(chǎn)品原料通過合適配比制成天然培養(yǎng)基（12 Brix 糙米汁∶12 Brix 麥芽汁∶12 Brix 豆芽汁= 4∶4∶2），考查釀酒酵母培養(yǎng)條件，使得有機(jī)硒比率達(dá)90%以上，同時(shí)大大節(jié)約了培養(yǎng)基成本。

目前，一些價(jià)格低廉、獲取途徑廣泛的農(nóng)副產(chǎn)品被大量廢棄，如糖蜜、麩皮。糖蜜富含有糖類、核酸、菌體蛋白及促生長(zhǎng)因子等成分，而麩皮也不乏脂肪、糖類、纖維素和礦物質(zhì)。因此，以糖蜜作為富硒酵母培養(yǎng)基的基本成分，以麩皮作為輔助原料對(duì)啤酒酵母進(jìn)行富硒培養(yǎng)，將為富硒酵母的開發(fā)提供一定的參考依據(jù)。

3 酵母富硒的培養(yǎng)條件

在富硒酵母的培養(yǎng)過程中，硒源的添加量、添加方式和培養(yǎng)條件成為酵母富硒培養(yǎng)過程中的主要影響因素。

3.1 硒添加量

考慮到培養(yǎng)基的硒濃度會(huì)影響酵母對(duì)硒的轉(zhuǎn)化吸收和酵母生物量的積累，低濃度的硒對(duì)酵母的生長(zhǎng)影響不顯著，隨著濃度的增加，酵母中的富硒量也隨之增加；當(dāng)培養(yǎng)基中硒的濃度過高時(shí)，會(huì)抑制酵母的生物量和有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率的提高。

從有機(jī)硒的富集效果方面考慮，王鳳琴[11]在麥芽汁培養(yǎng)基中對(duì)硒的添加濃度進(jìn)行單因素分析，綜合富硒效果和酵母生長(zhǎng)狀況，確定150 mg/kg 為最佳硒含量。王歲樓等人[12]對(duì)硒源進(jìn)行篩選后，從經(jīng)濟(jì)和技術(shù)考慮選定亞硒酸鈉，采用15 mg/L 硒質(zhì)量濃度對(duì)郁金香牌高活性酒精干酵母進(jìn)行富硒培養(yǎng)，硒轉(zhuǎn)化率達(dá)83.2%。

為了獲得較高的有機(jī)硒轉(zhuǎn)化量，研究更偏向于對(duì)酵母進(jìn)行育種篩選后進(jìn)行富硒。劉培麗等人[13]對(duì)啤酒酵母采用化學(xué)誘變后，經(jīng)亞硒酸鈉抗性平板篩選出無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)菌株，經(jīng)過比較生物量，發(fā)現(xiàn)N-5-1 菌株具有較強(qiáng)富集硒能力和生長(zhǎng)活力。研究表明，當(dāng)酵母培養(yǎng)液中加入25 mg/L 硒（Se4+） 時(shí)，在發(fā)酵物中硒含量高達(dá)2 454 μg/g。

吳寶強(qiáng)等人[14]研究發(fā)現(xiàn)隨著酵母菌株不同，對(duì)亞硒酸鈉的耐受程度差異也較大，在平衡富硒量及酵母生物量二者后，確定硒酵母培養(yǎng)基的最佳初始硒質(zhì)量濃度為25 μg/mL。

在實(shí)際生產(chǎn)過程中，應(yīng)該根據(jù)菌種類型、是否進(jìn)行耐硒訓(xùn)練和誘變處理等情況來確定最佳加硒質(zhì)量濃度，以獲得具有高富硒量和高生物量的酵母菌種來優(yōu)化酵母富硒生產(chǎn)參數(shù)。

3.2 加硒方式

在酵母菌的培養(yǎng)過程中，其繁殖過程一般會(huì)經(jīng)歷4 個(gè)時(shí)期，分別是延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。因?yàn)閷?duì)數(shù)期的酵母菌繁殖速率最快，所以在這個(gè)時(shí)期的前期加入硒源有利于硒的富集；考慮到硒源被酵母菌吸收后會(huì)轉(zhuǎn)化到次級(jí)代謝產(chǎn)物中，在穩(wěn)定期的前期硒源應(yīng)該加到培養(yǎng)基中；在富硒培養(yǎng)的初期，應(yīng)少量添加硒源，這樣避免了高濃度的硒對(duì)酵母生長(zhǎng)的抑制作用；在發(fā)酵中后期，應(yīng)逐步增加硒的添加量，這樣有利于硒的轉(zhuǎn)化。因此，應(yīng)該采取分批次添加硒源。

在分批次添加硒源時(shí)，劉杰等人[6]考慮到大于30 mg/L 初始的Na2SeO3·H2O 對(duì)酵母細(xì)胞的得率有影響，所以在進(jìn)行酵母富硒培養(yǎng)時(shí)，提前添加一定質(zhì)量濃度（5～30 mg/L） 的Na2SeO3·H2O，且分別培養(yǎng)到12，16，19，22 h 后補(bǔ)加10 mg/L Na2SeO3·H2O，使硒源總添加量在45～70 mg/L。研究發(fā)現(xiàn)10 mg/L Na2SeO3·H2O 初始添加量有利于硒的富集和酵母的生長(zhǎng)，而超過10 mg/L 則使酵母生長(zhǎng)受到抑制。

婁興丹等人[15]在富硒土壤中篩選出黏紅酵母RhodotorulaglutinisX-20，分5 次添加質(zhì)量濃度為50 μg/mL 的Na2SeO3，分別在培養(yǎng)的6，9，12，16，24 h，黏紅酵母富硒情況表明，在12 h 時(shí)添加硒鹽效果最佳，酵母富硒量為2 520.65 μg/g，菌種生物量為4.21 g/L。

史澤旭等人[16]為促進(jìn)菌種生長(zhǎng)和有機(jī)硒的富集轉(zhuǎn)化，改變了傳統(tǒng)碳源和Na2SeO3的添加方式，采用碳源指數(shù)流加法和亞硒酸鈉流加法，使有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率較恒速流加提升了8.1%，酵母干質(zhì)量可達(dá)1.5 g/L，該流加硒源方式將為富硒酵母工業(yè)化生產(chǎn)提供新思路。

3.3 培養(yǎng)條件

不同的培養(yǎng)條件會(huì)影響酵母的富硒能力和酵母干重的積累，蔡飛等人[17]研究庫(kù)德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii） Z5 發(fā)酵條件，在優(yōu)化接種量時(shí)，分別對(duì)4%，6%，8%，10%，12%接種量進(jìn)行試驗(yàn)，終確定10%接種量效果最好，在最佳培養(yǎng)條件下，總硒含量可達(dá)到862 μg/g，生物量為9.63 g/L。

除了酵母接種量、碳源及加硒方式會(huì)對(duì)生物量和富硒含量有影響外，溫度、pH 值、接種量、裝液量也會(huì)對(duì)此產(chǎn)生影響。何彩梅等人[18]從自然柑橘果酒篩選分離出假絲酵母，確定其對(duì)75 μg/mL 亞硒酸鈉有最佳轉(zhuǎn)化效果后，在溫度為32 ℃，初始pH 值為4.4，接種量為5%，裝液量為200 mL/250 mL 的搖瓶條件進(jìn)行培養(yǎng)，優(yōu)化后菌株生物量高達(dá)2.57 g/L，總硒含量測(cè)得可達(dá)4 756.76 μg/L。

孫平平等人[19]通過單因素試驗(yàn)分析和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究了安琪活性干酵母培養(yǎng)溫度、初始pH 值和轉(zhuǎn)速等發(fā)酵條件對(duì)酵母生物量及富硒量的影響，并確定了最優(yōu)方案為培養(yǎng)溫度30 ℃，初始pH 值5.0，轉(zhuǎn)速160 r/min，培養(yǎng)時(shí)間40 h，最終生物量達(dá)到9.89 g/L，同時(shí)取得較好的富硒效果。

4 結(jié)語(yǔ)

富硒酵母是在酵母培養(yǎng)中加入亞硒酸鈉，通過酵母的生長(zhǎng)及代謝過程轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒。用富硒酵母作為原料，可進(jìn)一步加工成富硒酵母抽提物，作為營(yíng)養(yǎng)添加劑和保健產(chǎn)品及藥物原料?，F(xiàn)階段，國(guó)內(nèi)已有以富硒酵母為主要成分的北大富硒康口服液，食品級(jí)的富硒酵母等商品在售。目前，大多數(shù)富硒酵母培養(yǎng)基使用的是麥芽汁培養(yǎng)基或者合成培養(yǎng)基，今后有待于以糖蜜、麩皮為原料來制作富硒酵母的培養(yǎng)基，進(jìn)一步優(yōu)化富硒培養(yǎng)條件，降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品有機(jī)硒含量，為降低富硒產(chǎn)品價(jià)格提供有效的解決途徑。