王德飛 秦 爽 劉 紅

微球(microspheres，MS)是一種將藥物分子包裹于高分子聚合物中以實(shí)現(xiàn)藥物長(zhǎng)時(shí)間平穩(wěn)釋放的緩釋藥物傳遞系統(tǒng)，是粒徑尺寸大小分布在5～250μm 之間的球狀實(shí)體[1]。制備微球的材料有明膠、海藻酸鈉、聚乳酸(polylactide，PLA)、聚乳酸·羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)等[2]。其中，明膠是應(yīng)用最廣泛的微球材料之一。明膠微球具有制備簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉、載藥量高、分散性好、組織相容性好和生物可降解性等多種優(yōu)勢(shì)[3]。尤其在口腔頜面骨缺損的修復(fù)、種植修復(fù)、牙髓再生、牙周組織再生領(lǐng)域被用作載體時(shí)，在提高生長(zhǎng)因子和藥物穩(wěn)定性、減緩?fù)会尩确矫嫒〉幂^為理想的效果。制備明膠微球的常用方法有乳化溶劑萃取法、相分離法、噴霧干燥法、膜乳化法[4]。

1.制備方法

1.1 乳化溶劑萃取法 乳化溶劑萃取法是制備微球應(yīng)用最廣泛的方法。首先將制備微球的材料在有機(jī)溶劑中溶解，形成油相；油相通過(guò)均勻化和超聲等物理方法在含有乳化劑的連續(xù)水相中乳化，溶劑萃取進(jìn)入水相，然后蒸發(fā)溶劑、過(guò)濾、洗滌和凍干得到微球。根據(jù)用于微球制備的乳化液數(shù)量，乳化溶劑萃取法可分為單乳溶劑萃取法和雙乳溶劑萃取法[5-8]。該方法主要優(yōu)點(diǎn)是不需要任何專門的設(shè)備可以在廣泛尺寸范圍內(nèi)批量生產(chǎn)微球，并且可選擇合適的溶劑將生物活性分子封裝在微球材料中，但是此方法的成本較高，難以控制微球的粒徑分布，水溶性生物活性分子(如蛋白質(zhì))的包封效率相對(duì)較低[4]。

1.2 相分離法 將制備微球的材料溶解在溶劑中，然后將溶液通過(guò)注射器/針頭或壓電噴嘴滴加到液氮中，將溫度降至低于溶劑的冰點(diǎn)使相分離；通過(guò)升華或浸出去除溶劑，生成具有多孔形態(tài)特征的微球[9]。該制備方法簡(jiǎn)單可行，但易受溶液濃度和控制溫度的影響。

1.3 噴霧干燥法 將制備微球的材料溶解于低沸點(diǎn)的有機(jī)溶劑中，形成單相或多相的膠體；然后將溶液霧化、氮?dú)飧稍?，通過(guò)對(duì)干燥室進(jìn)出口溫度調(diào)整可以制備不同形態(tài)的微球[10]。一般情況下，噴霧干燥法制備的微球受工藝參數(shù)的影響很大，其粒徑和產(chǎn)率主要受聚合物濃度和泵速的影響[11]。

1.4 膜乳化法 以聚乙烯醇和十二烷基硫酸鈉為連續(xù)相，將制備微球的材料溶于二氯甲烷成為分散相，通過(guò)施加氮?dú)鈮毫π纬删鶆蛞旱危蝗缓笸ㄟ^(guò)微攪拌的連續(xù)相流動(dòng)分離出液滴形成O/W 乳液；最后蒸發(fā)二氯甲烷、液滴凝固，獲得均勻的微球。膜乳化過(guò)程中獲得均勻液滴的關(guān)鍵是分散相與親水性膜之間高的界面張力，否則液滴會(huì)在膜上擴(kuò)散，難以自發(fā)分離。膜乳化法的最大優(yōu)點(diǎn)是獲得高包封率的均勻微球，并可通過(guò)選擇微球尺寸來(lái)調(diào)控微球的釋放行為，而且溫和的制備條件可以保持蛋白質(zhì)/肽類藥物的生物活性[12]。

明膠微球具有優(yōu)良的性能及多樣化的制備方法，為其在口腔領(lǐng)域的應(yīng)用提供了條件。下面，就目前利用不同方法制備的明膠微球在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)行闡述。

2.應(yīng)用

2.1 口腔頜面外科領(lǐng)域應(yīng)用 針對(duì)頜骨的骨缺損，以往多采用全身性的藥物治療，但全身用藥常伴隨一定的并發(fā)癥，因此可以考慮局部應(yīng)用促進(jìn)成骨的各類生長(zhǎng)因子對(duì)其進(jìn)行治療。

降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin gene related peptide，CGRP)對(duì)局部調(diào)控骨代謝起著重要作用，不僅可以促進(jìn)成骨細(xì)胞中環(huán)磷酸腺苷的形成，刺激骨髓干細(xì)胞有絲分裂和間充質(zhì)細(xì)胞的分化，而且能通過(guò)與破骨細(xì)胞的降鈣素受體結(jié)合來(lái)抑制破骨細(xì)胞的骨吸收活性[13]。劉偉等[14]利用乳化交聯(lián)的方法制備負(fù)載不同濃度的CGRP 的明膠緩釋微球，并將其植入骨質(zhì)疏松兔的股骨缺損中。組織學(xué)顯示CGRP在濃度為10-6mol/L 時(shí)其新生骨組織比例最高。最終結(jié)果證明負(fù)載CGRP 的明膠緩微球的緩釋時(shí)間可達(dá)20 天且有效地促進(jìn)骨質(zhì)疏松兔骨質(zhì)缺損區(qū)的成骨。

類胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factors-1，IGF-1)可明顯提高生物材料的生物活性，促進(jìn)有絲分裂，刺激成骨細(xì)胞的增殖及膠原合成，促進(jìn)骨折的愈合，且有時(shí)間和劑量依賴性[15]。落全祥等[16]用乳化交聯(lián)法制備IGF-1/明膠微球復(fù)合物，平均粒徑為(20.33±3.67)um，將其置于兔下頜骨缺損處以作為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組植入空白明膠微球(GMs)。從血清學(xué)方面觀察其對(duì)兔下頜骨缺損修復(fù)的影響。研究表明IGF-1/GMs12 天時(shí)IGF-1累計(jì)釋放率達(dá)93%，能促進(jìn)頜骨缺損早期愈合。

乳鐵蛋白作為一種新型的骨生長(zhǎng)因子，通過(guò)調(diào)節(jié)骨的生長(zhǎng)和代謝過(guò)程發(fā)揮功能，促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)。Ulas,G?rmez 等[17]用乳化交聯(lián)法制備加載牛乳鐵蛋白(bovine lactoferrin，bLF)的明膠微球，觀察其與有機(jī)牛骨結(jié)合后在骨骼再生上的作用。結(jié)果表明明膠微球作為載體24 天內(nèi)釋放了約3mgbLF，有利于發(fā)揮bLF 促進(jìn)成骨細(xì)胞活性的作用，并且通過(guò)增加微球的交聯(lián)密度，可以將bLF 釋放的持續(xù)時(shí)間從幾個(gè)小時(shí)延長(zhǎng)至幾周。

2.2 種植、修復(fù)領(lǐng)域應(yīng)用 口腔種植領(lǐng)域最新研究熱點(diǎn)主要是如何改進(jìn)種植體表面處理方式在達(dá)到促進(jìn)早期骨結(jié)合目的的同時(shí)，降低種植體周圍感染的發(fā)生。鈦及其合金材料由于具有良好的生物相容性和機(jī)械性能，現(xiàn)已廣泛用于牙植入體、骨科及整形外科等領(lǐng)域。盡管鈦基植入材料具有優(yōu)良的性能，但其存在的骨整合性差和細(xì)菌感染問(wèn)題，往往會(huì)導(dǎo)致臨床植入手術(shù)的失敗。

有資料顯示，電泳沉積是一種利用溶劑中帶電粒子或分子在基片材料表面聚集的處理技術(shù)，廣泛適用于處理生物分子和生物實(shí)體的表面[18]。電泳沉積技術(shù)因其成本相對(duì)低廉、所需設(shè)備簡(jiǎn)單、能在室溫和高純度條件下對(duì)材料進(jìn)行加工，以及能夠產(chǎn)生大范圍的涂層厚度和包覆復(fù)雜的三維和多孔結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起了越來(lái)越多的關(guān)注[19]。研究顯示通過(guò)電泳沉積技術(shù)在鈦表面成功地制備的殼聚糖/明膠涂層，為進(jìn)一步負(fù)載功能性分子提供了基礎(chǔ)[20]。

研究證明骨保護(hù)素(osteoclastogenesis inhibitory factor，OPG)可以有效預(yù)防骨吸收[21]?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)/基質(zhì)細(xì)胞衍生因子受體(CXCR4)被證實(shí)參與組織再生和器官形成，越來(lái)越多的證據(jù)表明SDF 對(duì)于牙齒以及骨骼的組織再生或修復(fù)起著不可或缺的作用[22]。馬瑞[23]采用振蕩滲涂交聯(lián)法將雙層包載重組人骨形成蛋白-2(Recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)/SDF-1/OPG 明膠微球交聯(lián)于純鈦微弧氧化涂層的微孔中，成功制備出新型功能性涂層。研究顯示：新型功能性涂層不僅表面形貌良好，pH 值在7.4 時(shí)30 天內(nèi)三種因子釋藥率可達(dá)80%，并且具有一定的促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞募集歸巢、促進(jìn)其向成骨分化的能力以及一定的抑制破骨細(xì)胞分化成熟的作用。

種植體周圍炎對(duì)種植體的長(zhǎng)期穩(wěn)定產(chǎn)生很大的影響，會(huì)引起骨吸收甚至種植失敗[24]。研究表明種植體周圍炎的發(fā)病率高達(dá)47%[25]。牙周炎患者較牙周健康人群對(duì)種植體周圍炎有著更高的易感性，研究表明有牙周炎病史的患者相較于牙周健康患者，種植后長(zhǎng)期效果不佳，表現(xiàn)為探診深度更大，邊緣骨吸收嚴(yán)重，以及種植體周圍炎發(fā)生的可能性增加[26]。Lu han[27]等制備了負(fù)載骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein2，BMP-2)和萬(wàn)古霉素(Van)的GMs-GO/Ti 支架緩釋系統(tǒng)。研究表明Van 在GMs-GO/Ti 支架上表現(xiàn)為緩釋，21d 后釋放率為63.4±3.4%；純Ti 支架中BMP 2 的釋放速率高于GMs-GO/Ti 支架材料的BMP-2 釋放速率。用GMs 分別包封小分子藥物和蛋白質(zhì)，可以使藥物和蛋白質(zhì)得到有效的釋放。利用了GMs 的高承載能力和GO 的高比表面積，賦予支架具有骨誘導(dǎo)和抗菌雙重功能，滿足骨組織再生的要求。

2.3 牙體牙髓領(lǐng)域的應(yīng)用 再生牙髓學(xué)的目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的再生。牙髓干細(xì)胞在牙體組織再生過(guò)程中具有巨大的潛在價(jià)值[28]。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)被認(rèn)為在牙源性分化中扮演著重要的角色。Srisuwan T[29]建立了一個(gè)研究牙髓干細(xì)胞(Dental pulp stem cells，DPSCs)存活和生成牙髓組織潛能的體內(nèi)模型。將DPSCs 與含或不含緩釋骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(BMP-4)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2)的明膠微球混合。明膠微球的孔隙率為94.24±0.52%，表觀密度為94.24±0.52%。30 天內(nèi)累計(jì)緩釋率達(dá)90%。細(xì)胞懸液被移植到大鼠腹股溝帶血管蒂的組織工程室，2 周后，觀察到腔內(nèi)新生組織和新生血管的形成。在牙本質(zhì)周圍，特別是血管蒂周圍和明膠微球附近發(fā)現(xiàn)DPSCs。移植8 周后細(xì)胞存活。牙本質(zhì)涎磷蛋白陽(yáng)性基質(zhì)的產(chǎn)生，顯示出牙髓祖細(xì)胞的再生功能。本研究證明了該組織工程模型在研究大鼠牙髓細(xì)胞及其在牙髓再生方面的潛力，為利用這一技術(shù)尋找替代療法提供了可能。

全根管牙組織再生一直是再生牙髓學(xué)領(lǐng)域面臨的最大挑戰(zhàn)之一，也是其臨床應(yīng)用的最大障礙之一。Li X 等[30]設(shè)計(jì)并合成了一個(gè)獨(dú)持的層次化負(fù)載生長(zhǎng)因子的納米纖維微球支架系統(tǒng)。在該體系中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)與肝素結(jié)合，被包裹在肝素偶聯(lián)的明膠納米球中，并在可注射左旋聚乳酸(poly(Llactide)，PLLA)微球的納米纖維中進(jìn)一步固定。這種分層微球系統(tǒng)不僅可以避免VEGF 變性和加速降解，而且可以很好地控制其持續(xù)釋放。此外，納米纖維PLLA 微球融合了細(xì)胞外基質(zhì)模擬結(jié)構(gòu)和多孔注射形式，有效容納DPSCs，支持其增殖和牙髓組織形成。體內(nèi)研究顯示，髓樣組織在整個(gè)根尖和根中三分之一成功再生，并達(dá)到了全根管冠方三分之一。

2.4 牙周領(lǐng)域應(yīng)用 牙周組織工程是本世紀(jì)初提出的一種基于分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的牙周再生新范式。實(shí)現(xiàn)牙周再生是治療晚期牙周炎所致牙周缺損的重要臨床目標(biāo)。牙周再生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及到各種細(xì)胞類型的分化，并在正確的位置和環(huán)境中產(chǎn)生足夠數(shù)量的細(xì)胞[31]。生長(zhǎng)因子通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞活性、趨化性和細(xì)胞分化促進(jìn)牙周膜內(nèi)某些細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化[32]。從理論上講，生長(zhǎng)因子通過(guò)激活和分化所需的細(xì)胞類型，可以使牙周組織再生。生長(zhǎng)因子是一種內(nèi)源性信號(hào)分子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞在機(jī)體修復(fù)過(guò)程中的遷移、增殖和分化。但是其存在穩(wěn)定性差、體內(nèi)半衰期短等缺點(diǎn)[33]。如何使生長(zhǎng)因子持續(xù)、高效釋放以促進(jìn)種子細(xì)胞定向分化和維持細(xì)胞表型是當(dāng)前面臨的關(guān)鍵性問(wèn)題之一[34]。Nakahara T[35]等以膠原海綿支架和含有堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的明膠微球組成的夾心膜作為緩釋系統(tǒng)植入到比格犬雙側(cè)牙槽骨缺損處，研究表明：明膠微球作為bFGF 載體起著重要的作用。在其植入后4 周內(nèi)維持穩(wěn)定的bFGF的釋放，牙周組織內(nèi)有大量毛細(xì)血管增生和新生骨形成。

3.展望

明膠微球含有許多化學(xué)官能團(tuán)，包括羧基、硫醇、羥基和氨基，對(duì)生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子具有較高的負(fù)載能力。除蛋白質(zhì)外，GMs 還能包封小分子藥物，如萬(wàn)古霉素、多索紅霉素和雙氯芬酸鈉。由于其優(yōu)異的生物相容性、低毒和大劑量的承載能力，已顯示出作為化學(xué)藥物和基因運(yùn)載載體的潛在應(yīng)用前景;另外多孔明膠微球密度低，比表面面積大，吸收性能好，在組織再生支架的研制中有著廣泛的應(yīng)用前景[36]。雖然制備具有預(yù)定義孔隙率的明膠微球仍有很大的挑戰(zhàn)性[37]。但隨著明膠微球制備方法的不斷改進(jìn)和創(chuàng)新，其在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。