王 楠 王 曦 高 蕾 陳 子 周林福,2,3

支氣管哮喘(哮喘)是多基因參與的具有遺傳易感性的慢性氣道炎癥性疾病，其發(fā)病涉及多種炎癥細胞、炎癥介質(zhì)和復雜的細胞因子網(wǎng)絡，以血清IgE增高、氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑為顯著的臨床特征[1]。Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)是果蠅受體Toll同源物，作為固有免疫系統(tǒng)的一種重要的模式識別受體，連接著機體固有免疫和適應性免疫。目前已鑒定人類14種TLR。越來越多的證據(jù)表明，TLR在炎癥性和免疫性疾病中扮演著重要的角色[2-4]。其中，TLR4與哮喘的發(fā)生發(fā)展密切相關[5-6]。靶向TLR4及其信號通路，為治療哮喘提供了新的思路。本文將就TLR4信號轉導通路、TLR4與哮喘發(fā)病機制、靶向TLR4治療哮喘的研究進展做一綜述。

一、 TLR4結構及其信號轉導

自從TLR在人類首次被識別[7]，加上新近發(fā)現(xiàn)的TLR13[8]，目前在哺乳動物中已鑒定了14種TLR。其中，TLR4為I型跨膜糖蛋白，包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)3個部分。胞外區(qū)由16～28個亮氨酸重復序列組成，識別外源性病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)以及內(nèi)源性損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMP)。胞內(nèi)區(qū)是結構相對保守的Toll/IL-1受體(TIR)結構域，負責起始胞內(nèi)信號轉導[9]。

革蘭氏陰性菌細胞壁外膜的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)為TLR4 的天然配體。結晶學分析顯示，LPS結合TLR4-髓樣分化蛋白2(myeloid differentiation 2, MD2)異源二聚體，導致“M”型TLR4-MD2-LPS受體多聚體形成，該多聚體由兩個結構對稱的TLR4-MD2-LPS復合物組成。 LPS位于MD-2組成的疏水性口袋內(nèi)，連接受體多聚體的兩個部分。在LPS 6條脂質(zhì)鏈中，5條鏈埋在MD2組成的疏水性口袋內(nèi)，只有一條鏈暴露在MD2表面，與TLR4的苯丙氨酸疏水區(qū)相結合[10]。LPS與TLR4結合導致受體復合物二聚化，使兩個TLR4的TIR 結構域結合更加緊密，進而導致受體復合物結構改變并募集下游接頭蛋白。

當接頭蛋白髓細胞樣分化標志88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)激活，可依次募集IL-1R 相關蛋白激酶4(IRAK4)、IRAK1、IRAK2 和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)受體相關因子 6(TRAF6)。TRAF6激活轉化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)活化的蛋白激酶1(TAK1)、TAK2 和TAK3 復合物，繼而活化核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)抑制物(IκB)激酶復合物(IKK復合物)，IKK復合物則催化IκB蛋白磷酸化降解。于是，NF-κB核轉錄信號暴露并發(fā)生核移位，啟動IL-6、IL-12 p40 或TNF等多種炎癥基因轉錄。TRAF6還可以通過激活絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)和干擾素調(diào)節(jié)因子5(interferon regulatory factor 5, IRF5)促進炎癥應答。這就是TLR4的 MyD88依賴途徑。另外，TLR4還可以通過含誘導干擾素β(interferon-β, INF-β)接頭蛋白的TIR 域(TRIF)依賴途徑，通過TRIF相關接頭蛋白分子(TRAM)，最終導致IRF3和NF-κB的活化及核轉錄。IRF3核轉錄啟動Ⅰ型干擾素基因表達[11]。

除了識別外源性微生物表面PAMP，TLR4還能識別內(nèi)源性危險信號分子，包括高遷移率族蛋白B1(high mobility group box protein 1, HMGB1)、熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)、S100蛋白等[12-13]。其中，HMGB1與哮喘尤其是重癥哮喘的關系最為密切[14]。HMGB1可經(jīng)TLR4和/或晚期糖基化終產(chǎn)物受體(the receptor for advanced glycation end products, RAGE)，促進細胞外基質(zhì)合成，參與人支氣管上皮細胞的損傷修復[15]。哮喘小鼠肺組織HMGB1、TLR4和NF-κB的表達顯著高于對照組，并與氣道壁厚度呈正相關，這表明HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路可能參與哮喘氣道重塑。另外，HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路還可能與哮喘氣道炎癥的形成有關[16]。

二、TLR4在哮喘發(fā)病機制中的作用

哮喘是一種異質(zhì)性氣道變應性疾病，表現(xiàn)為多變的臨床表型和復雜的基因型。哮喘發(fā)病不僅涉及宿主遺傳易感性，還與免疫紊亂(如Th2優(yōu)勢免疫)以及環(huán)境暴露等因素有關?；?免疫-環(huán)境交互作用，促進了哮喘的發(fā)生發(fā)展。

1. TLR4連接衛(wèi)生假說和過敏進程: 哮喘流行病學揭示了兩個備受矚目的經(jīng)典現(xiàn)象，包括衛(wèi)生假說(hygiene hypothesis)和過敏進程(atopic march)。衛(wèi)生假說認為，隨著個人衛(wèi)生提高，家庭設施改善，家庭規(guī)模下降，過敏癥(變態(tài)反應)發(fā)病率反而顯著增高，比如花粉癥、濕疹和哮喘[17]。據(jù)此推測，兒童早期感染或有裨益，并有助于降低成年哮喘等過敏癥的發(fā)病率。其實，通過接觸病原微生物或影響共生菌群，或兩者兼而有之，皆可促進免疫系統(tǒng)早期成熟，增強Th1免疫，從而調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡。皮膚過敏原致敏時，一旦TLR激活(TLR4結合配體LPS或TLR2結合配體Pam3Cys)，即可上調(diào)保護性Th1免疫，有利于阻遏哮喘發(fā)展[18]。而且，罹患過敏癥兒童的單核細胞對LPS的反應性受損[19]，這說明TLR4及其信號通路與衛(wèi)生假說現(xiàn)象密切相關。

若在生命早期患有特應性皮炎(atopic dermatitis, AD)，隨后易于罹患其他過敏癥，譬如過敏性鼻炎和哮喘，稱為過敏進程[20]。這說明哮喘的致病途徑可能始于皮膚，繼而累及氣道，并印證皮膚屏障的完整性在防治哮喘中至關重要。業(yè)已證明，TLR4在角質(zhì)形成細胞中表達，并參與皮膚抗微生物感染及損傷修復[21-22]?；蛟S，TLR4參與早期調(diào)節(jié)固有免疫系統(tǒng)，同時在啟動和促進過敏進程中發(fā)揮作用。由此可見，衛(wèi)生假說具有保護作用，可能緣于機體把過敏原視為微生物來源。若外源性微生物和/或機體自身共生菌群在固有免疫系統(tǒng)發(fā)育早期減少，過敏原則失去TLR微生物配體(如LPS、Pam3Cys)作為共刺激分子。因此，反復過敏原刺激將不斷加劇Th2免疫，甚至引起更為嚴重的過敏癥，即過敏進程[18, 23]。

2. TLR4介導過敏性哮喘： 作為固有免疫系統(tǒng)中結構和生物學特性剖析最透徹的模式識別受體，TLR4與哮喘發(fā)病密切相關。塵螨、蟑螂、花粉、真菌是哮喘常見的過敏原。在屋塵螨(house dust mite, HDM)中，LPS以TLR4依賴方式引起過敏性哮喘，而β葡聚糖則以TLR2依賴方式激活鼻黏膜固有免疫并導致過敏性鼻炎。顯然，鼻部和肺部存在不同的免疫應答形式[24]。造血細胞TLR4的表達，可參與過敏原和吸入性LPS所致的中性粒細胞反應，而氣道上皮細胞TLR4的表達則參與吸入過敏原介導的嗜酸性粒細胞反應。這證明不同細胞表達的TLR4對吸入過敏原產(chǎn)生的免疫應答具有不同調(diào)控作用[25]。而且，LPS劑量的高低會影響哮喘組織學類型。其中，低劑量LPS暴露時，卵蛋白(ovalbumin, OVA)誘導的哮喘小鼠肺組織呈嗜酸性粒細胞和中性粒細胞浸潤為主，氣道黏液呈高分泌，表現(xiàn)為Th2優(yōu)勢免疫。中高劑量 LPS暴露時，OVA哮喘小鼠反而出現(xiàn)中性粒細胞浸潤為主，氣道黏液呈高分泌，并誘導Th1免疫應答。

有趣的是，富含LPS的OVA可引起Th1、Th2混合型免疫應答，而不含LPS的OVA只能引起Th2優(yōu)勢免疫[26]。而且，低劑量LPS刺激的中性粒細胞可誘導人外周血嗜酸性粒細胞跨基底膜遷移，參與重癥哮喘的發(fā)生發(fā)展[27]。HDM通過誘導氣道上皮細胞而非免疫細胞TLR4活化，即可釋放天然細胞因子如IL-25、IL-33和胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)并致敏，促進形成哮喘Th2優(yōu)勢免疫[28]。樹突狀細胞(dendritic cell, DC)依賴FcRγ、TLR4和磷脂酰肌醇3激酶(phospholipid polymyo-inositol 3 kinase, PI3K)誘導Th2優(yōu)勢免疫，其中上調(diào)IL-33是主要機制之一[29]。

TLR2、TLR3和TLR4活化在過敏原經(jīng)皮膚致敏產(chǎn)生過敏性哮喘中發(fā)揮調(diào)控作用。表皮微生物經(jīng)皮致敏后，通過LPS、Pam3Cys分別活化TLR4、TLR2，可降低或消除過敏性哮喘，并且LPS、Pam3Cys上調(diào)真皮DC細胞表面協(xié)同刺激分子CD80和CD86，促進DC活化并導致更多的 CD8+T細胞產(chǎn)生，支氣管肺泡灌洗液(BALF)IFN-γ水平增加，引起免疫應答向Th1型偏移[18]。而且，空氣源性微生物產(chǎn)物暴露對過敏性哮喘尚有抑制作用。實際上，該免疫調(diào)節(jié)既不促進Th1免疫應答，也不依賴于調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)和分泌IL-10，而是依賴于TLR4并且不涉及TLR脫敏。DC向引流淋巴結遷移及T細胞活化并未受影響，只是肺部活化的DC減少且抗原呈遞能力受損。因此，原位Th2細胞因子產(chǎn)生減少。并且，γδ T細胞也介導了對氣道高反應性的抑制作用[30]。另外，TLR4信號通路既參與OVA誘導的過敏性氣道疾病，又調(diào)節(jié)肺炎鏈球菌介導的對其抑制作用[31]。

TLR4還可協(xié)同其他受體，在哮喘急性加重中發(fā)揮作用。TLR3配體poly (I:C)和LPS 聯(lián)合作用，可使哮喘小鼠氣道高反應性顯著增加。這與臨床上微生物感染引起哮喘急性加重相一致[32]?；旌闲赃^敏原HDM激活氣道上皮細胞釋放HMGB1，隨后依次激活TLR4、RAGE，繼而放大變態(tài)反應[33]。

3. TLR4基因多態(tài)性與哮喘臨床表型和嚴重程度： 在TLR4及其信號通路中，信號轉導分子的基因多態(tài)性不僅影響到哮喘發(fā)生，而且與哮喘患者的臨床特征相關[34]。研究發(fā)現(xiàn)，在CD14、TLR4、IRF3、TRAF6、TIRAP、TRIF、IKK-1、ST-2和SOCS1 九個基因中，有21個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)，并對LPS暴露時體外IgE的合成起調(diào)節(jié)作用。TLR4相關基因多態(tài)性與哮喘患者臨床征象相具有對應性，例如，癥狀性氣道高反應性(CD 14 rs2915863和rs2569191，TRIF rs4807000)，哮鳴音(ST-2 rs17639215，IKK-1 rs2230804 和TRIF rs4807000)，以及特應性(CD14 rs2915863和rs2569192，TRAF6 rs5030411，和IKK-1 rs2230804)[35]。就CD14 159而言，C等位基因和T等位基因分別與低水平、高水平血清總IgE有關。C等位基因還是中度和重度哮喘的危險因素。但是，TLR4 299 和399 基因型與哮喘表型之間無顯著的相關性[36]。不過，TLR4基因多態(tài)性還可能影響哮喘的嚴重程度[37]。

誠然，TLR4活化對過敏性哮喘的調(diào)節(jié)作用取決于接觸配體的數(shù)量、TLR4的亞細胞定位、過敏原的給藥途徑和方式以及TLR4與其他受體之間的協(xié)同作用等。此外，TLR4及其信號通路中信號轉導分子的基因多態(tài)性、個體的種族、性別、生活環(huán)境、社會經(jīng)濟地位和病理生理狀態(tài)等，也與哮喘密切相關。一系列炎癥細胞和細胞因子網(wǎng)絡參與了哮喘的發(fā)生發(fā)展，包括中性粒細胞、氣道上皮細胞、TSLP和絲聚蛋白等。

三、靶向TLR4及其信號通路治療哮喘的價值

TLR4在哮喘Th2優(yōu)勢免疫、基因型和臨床表型中起重要作用。TLR4活化是一個涉及多分子交互作用的復雜過程，包括LPS、CD14、MD-2、LPS結合蛋白(LPS-binding protein. LBP)以及MyD88 和TRIF等接頭蛋白。TLR4信號通路為哮喘免疫治療提供了多個潛在的治療靶點。

1. 抗LPS多肽： 合成的抗LPS多肽可與LPS結合，競爭性抑制LPS結合蛋白或其他哺乳動物蛋白與LPS相結合，從而阻止TLR4復合物激活，并抑制LPS誘導的細胞因子分泌[38]。而且， 通過中和細菌LPS，能夠抑制人巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α[39]。

2. TLR4拮抗劑： 隨著TLR4-MD2-LPS復合物胞外晶體結構被解密，應用虛擬篩選方法識別新型TLR4小分子拮抗劑的潛力大幅提高[10]。合成的LPS類似物Eritoran(E5564)可結合MD-2，防止LPS激活TLR4，有益于治療炎癥性疾病[40]。 Eritoran拮抗TLR4，緣于其無法像LPS一樣導致MD-2分子中F126位的5?轉移[10]。LipidIva是天然的TLR4拮抗劑，通過與LPS競爭結合MD-2，抑制人TLR4信號[41]。VIPER為來自痘苗病毒蛋白A46的新型肽抑制劑，可阻斷TIR-TIR結構域之間的交互作用，抑制TLR4依賴的信號通路[42]。 NovImmun NI0101 (NovImmune)是TLR4拮抗性抗體，能夠阻止受體二聚化。人源化TLR4單克隆抗體Hu 15C1通過結合FcγRI以及TLR4，使抗體的活性顯著增強[43]。據(jù)報道，人源化抗TLR4單抗Fab段能夠阻斷小鼠腹腔巨噬細胞TLR4信號轉導通路，從而有效逆轉LPS誘導的炎癥反應[44]。晚近，全人源抗人TLR4 抗體的真核表達載體被成功構建，獲得全分子抗 TLR4 IgG 抗體。而且，該重組全人源抗 TLR4 IgG 抗體與 TLR4 呈特異性結合，并具有顯著的中和作用，彰顯其對炎癥性疾病具有潛在的應用價值[45]。

3. 微小RNA(miRNA)： 自從發(fā)現(xiàn)了miRNA對免疫防御相關基因的調(diào)控作用，靶向氣道的miRNA有望成為哮喘抗炎治療的新策略。miR-487b通過抑制IL-33轉錄可負向調(diào)節(jié)骨髓源性巨噬細胞的活性，從而降低LPS誘導的促炎因子的產(chǎn)生[46]。miR-146靶向TLR信號轉導蛋白TRAF6和IRAK1，負向調(diào)節(jié)TRAF6和IRAK1 mRNA的水平[47]。miR-155靶向含有Src同源性2(SH2)結構域的肌醇5磷酸酶1(Src homology-2 domain-containing inositol 5-phosphatase 1, SHIP-1)，后者可負向調(diào)節(jié)NF-κB信號[48]。另外，調(diào)節(jié)TLR4信號通路的激酶(尤其是 IRAK4)活性、蛋白磷酸化和泛素化修飾以及阻斷凋亡抑制劑的活性，均為抗哮喘新藥研發(fā)提供了新思路。

4. 抗HMGB1抗體： 研究表明，重組HMGB1可激活DC并產(chǎn)生IL-23，活化的DC則促進初始T淋巴細胞(Th0細胞)產(chǎn)生Th17細胞因子IL-17A[49]?？笻MGB1中和抗體可抑制中性粒細胞性哮喘小鼠模型肺組織HMGB1表達、氣道炎癥和氣道高反應性。重組HMGB1 A盒(HMGB1拮抗劑)通過抑制DC介導的Th17細胞極化，能夠緩解中性粒細胞性氣道炎癥和氣道高反應性[50]。

5. 抗炎單體： 查爾酮衍生物L2H21是一種新型MD2抑制劑，可抑制LPS誘導的急性肺損傷(ALI)[51]。HMGB1和TLR4在LPS誘導的ALI大鼠肺組織顯著上調(diào)，且兩者呈顯著正相關。氯胺酮能抑制ALI大鼠HMGB1和TLR4的表達，并減輕LPS誘導的ALI[52]。黃豆苷元可顯著抑制ALI大鼠肺組織巨噬細胞和中性粒細胞浸潤，降低BALF炎癥因子水平，抑制TLR4和MyD88蛋白表達以及NF-κB激活[53]。魚腥草素鈉可抑制香煙煙霧和LPS聯(lián)合誘導的大鼠慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型肺的炎癥，并與調(diào)控TLR4/MyD88/NF-κB信號通路有關[54]。

TLR4的生物學功能取決于其在體內(nèi)分布的廣泛性及其信號通路的復雜性。TLR4不僅參與哮喘等免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展，而且涉及炎癥、腫瘤和感染性疾病的病理生理。作為固有免疫的模式識別受體，TLR4是機體防御外來微生物侵犯的第一道防線，并且位于信號轉導的上游。靶向TLR4可有效阻止下游復雜的信號轉導，有望成為治療過敏性哮喘乃至中性粒細胞性炎癥性疾病(包括重癥哮喘、COPD、ALI等)的潛在靶點[55]。TLR4將過敏進程與衛(wèi)生假說聯(lián)系起來。關于遺傳易感個體(譬如，某些絲聚蛋白等位基因攜帶者，或有嚴重過敏癥家族史的兒童)緣何易于對各種環(huán)境過敏原產(chǎn)生免疫應答亟待闡明[23]。深入剖析TLR4、MD2、LPS交互作用的獨特結構以及TLR4二聚化的分子機制，有望為研發(fā)有效的TLR4抑制劑提供依據(jù)。TLR4缺陷型基因工程小鼠的建立以及人源化抗TLR4單抗的成功構建，不僅為今后免疫治療哮喘提供了新的技術平臺，而且，在基因和表觀遺傳水平上進一步詮釋哮喘異質(zhì)性的本質(zhì)，無疑也為開發(fā)哮喘靶向治療藥物帶來了新的愿景。