白丹 倪菁 雷飛 嚴(yán)喜章 馬建梅

(西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 西安710021)

甲狀腺功能減退癥(hypothyroidism，HT)是內(nèi)分泌科的常見疾??；亞臨床甲狀腺功能減退(subclinical hypothyroidism ，SCH)是以促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)水平增高而甲狀腺功能正常為特征的代謝性疾病。近年來(lái)有研究表明，甲狀腺功能減退癥(HT)和亞臨床甲狀腺功能減退(SCH)患者均可發(fā)生心臟舒縮功能障礙[1]。而在SCH中僅有促甲狀腺素(TSH)升高，甲狀腺素水平正常，推測(cè)TSH在心臟舒縮功能障礙發(fā)生中可能發(fā)揮一定的作用。甲狀腺外的許多組織及細(xì)胞都存在TSH受體(TSHR)，TSH可通過(guò)與受體結(jié)合在這些組織細(xì)胞發(fā)揮病理生理作用[2]。Dong等[3]在研究中證實(shí)了原代大鼠心肌細(xì)胞表面TSHR的表達(dá)，而且發(fā)現(xiàn)高濃度長(zhǎng)時(shí)間的TSH作用于心肌細(xì)胞表面TSHR能夠明顯下調(diào)鈣離子、serca2a、Ryr2蛋白水平，通過(guò)對(duì)PKA/PLN信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制，影響心臟舒縮功能。本研究旨在探討TSHR在SCH小鼠心室肌細(xì)胞上的表達(dá)情況，為亞臨床甲狀腺功能減退與心臟舒縮功能障礙的關(guān)系研究提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 SCH動(dòng)物模型制備 30只7周齡BALB/c小鼠以普通飼料加蒸餾水適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組，每組15只。對(duì)照組小鼠飲用正常水。實(shí)驗(yàn)組小鼠按照Z(yǔ)hou 等[4]實(shí)驗(yàn)建模的方法建立SCH動(dòng)物模型，具體操作：每日以0.1% 丙硫氧嘧啶(PTU)溶液替代飲水，6周之后，腹腔注射4-苯基丁酸[100mg/(kg·d)](一種經(jīng)典抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的化學(xué)分子伴侶，可改善SCH模型小鼠中TSH介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng))，注射28天后完成SCH動(dòng)物模型的制備。對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。

1.2 超聲心動(dòng)圖檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行當(dāng)日各組均經(jīng)腹腔注射氯胺酮(75mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)麻醉小鼠后，采用超高分辨率多普勒超聲診斷儀(Visual Sonics Vevo 2100型，Canada)及相關(guān)分析軟件進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查，測(cè)量數(shù)據(jù)包括：脈沖多普勒二尖瓣E峰與組織多普勒二尖瓣環(huán)E’峰之比值(E/E’)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

1.3 血清TT3、TT4、TSH水平測(cè)定 各組小鼠摘取眼球取血，離心后采集血清，-80℃保存待測(cè)。放射免疫分析法檢測(cè)血清中總?cè)饧谞钕僭彼?TT3)、總四碘甲狀腺原氨酸(TT4)、促甲狀腺激素(TSH)水平。操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行(TT3、TT4、TSH放射免疫分析試劑盒均購(gòu)于天津市九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司)，抗體及試劑混勻后37℃溫育1h，加入分離劑后充分搖勻，室溫放置15min。離心前任取兩管測(cè)量，作為總放射性強(qiáng)度T，3500r/min，留沉淀物測(cè)量讀數(shù)。

1.4 小鼠心室組織TSHR免疫組織化學(xué)染色 各組小鼠開胸取出心臟，剪取心室組織，4%多聚甲醛，4℃固定24h。常規(guī)乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片(切片厚度5μm)，貼附于載玻片上，經(jīng)脫蠟、脫水、抗原修復(fù)、過(guò)氧化氫消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶等步驟后，使用TSHR抗體顯色試劑盒(購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司，一抗為兔抗小鼠TSHR多克隆抗體)，加入后4°C過(guò)夜，洗滌后再加入二抗，37℃孵育1h，洗滌；加入顯色液。按步驟進(jìn)行染色后，光鏡下觀察染色結(jié)果。陰性對(duì)照以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。

2 結(jié)果

2.1 兩組超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組E/E’值高于對(duì)照組(P<0.01)；兩組LVEF比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果比較Table 1 Echocardiography results in the groups

2.2 兩組血清TT3、TT4、TSH水平 兩組TT3水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);實(shí)驗(yàn)組血清TT4水平低于對(duì)照組;血清TSH水平明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，見表2。提示實(shí)驗(yàn)組小鼠造模成功。

表2 各組血清TT3、TT4、TSH水平比較Table 2 TT3, TT4 and TSH serum levels in the groups

2.3 兩組小鼠心室肌細(xì)胞TSHR免疫組織化學(xué)染色情況 光鏡下觀察各組小鼠心室肌細(xì)胞TSHR免疫組織化學(xué)染色情況，可見陽(yáng)性染色為棕黃色顆粒。實(shí)驗(yàn)組TSHR表達(dá)明顯高于對(duì)照組，見圖1。

3 討論

眾多研究表明甲狀腺功能減退可導(dǎo)致多種心臟疾病的發(fā)生。甲狀腺功能減退即甲狀腺素的合成或分泌減少或者是分泌的甲狀腺素生物效價(jià)降低[5-6]，而甲狀腺素可以通過(guò)影響心肌組織細(xì)胞內(nèi)的鈉-鉀-ATP 酶的活性及影響HMG-CoA 還原酶(HMGCR)的合成從而使甘油三酯的清除率下降等一系列機(jī)制從而引起心臟傳導(dǎo)功能異常誘發(fā)心律失常或者加重冠狀動(dòng)脈粥樣硬化，增加冠心病的患病率；還可以通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白合成的變化來(lái)影響心肌肌凝蛋白ATP 酶的活性和功能，從而直接影響心肌收縮力和心排血量，導(dǎo)致冠脈痙攣、心肌缺血等[7-9]。

圖1 各組小鼠心室肌細(xì)胞TSHR免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×200)Figure 1 Results of TSHR immunohisto-chemical staining in ventricular myocytes of micein each group注：A. 陰性對(duì)照組；B. 對(duì)照組；C.實(shí)驗(yàn)組

除了甲狀腺功能減退引起心臟舒縮功能改變外，近年來(lái)關(guān)于亞臨床甲狀腺功能減退(SCH)對(duì)心血管系統(tǒng)的危害也逐漸被人們所認(rèn)識(shí)。在出現(xiàn)SCH時(shí)，心臟前負(fù)荷顯著減低，后負(fù)荷增加，心輸出量及每搏輸出量減少，影響左室舒張功能、損傷血管內(nèi)皮功能、增加C反應(yīng)蛋白(CRP)水平，從而增加冠心病和心力衰竭發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[10-12]。近幾年國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)高水平TSH與心臟功能之間相關(guān)性進(jìn)行了大量研究，高水平的TSH可嚴(yán)重影響肥厚性心肌病患者左心室的舒張功能[13-16]。研究表明在充血性心力衰竭患者中SCH和心衰的發(fā)生呈正相關(guān)，但在正常人群中則無(wú)[16]。除此之外，也有研究表明老年女性動(dòng)脈粥樣硬化和心肌梗死的發(fā)生與SCH有關(guān)[17]。

HT和SCH患者均可發(fā)生心臟舒縮功能障礙，而在SCH中僅有TSH水平升高，甲狀腺素水平正常，提示亞甲減時(shí)升高的血清TSH對(duì)心臟的舒縮功能改變有一定的影響。甲狀腺外的許多組織及細(xì)胞都存在TSH受體，TSH可通過(guò)與受體結(jié)合在這些組織細(xì)胞發(fā)揮病理生理作用。已有研究證實(shí)TSH受體存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，并發(fā)揮一定作用。TSH可通過(guò)直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)內(nèi)皮素、纖溶酶原激活物抑制物-1等的分泌，作用于平滑肌細(xì)胞促進(jìn)平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[19-20]。大量實(shí)驗(yàn)研究表明TSH受體存在于眶后成纖維細(xì)胞[21]，但對(duì)于TSHR是否也存在于心肌細(xì)胞的相關(guān)研究較少。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)亞臨床甲狀腺功能減退造模的實(shí)驗(yàn)組小鼠，超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)組小鼠心功能受損。實(shí)驗(yàn)組血清TT4水平明顯低于對(duì)照組，血清TSH水平明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，提示實(shí)驗(yàn)組小鼠造模成功。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法結(jié)果提示心室肌組織中存在一定的TSHR表達(dá)，當(dāng)亞甲減發(fā)生時(shí)，心室肌組織中的TSHR表達(dá)上調(diào)。黃雯[22]在相關(guān)研究中探討了心室肌TSHR表達(dá)上調(diào)的具體機(jī)制及功能，通過(guò)體內(nèi)、外試驗(yàn)證實(shí)TSH可通過(guò)cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路上調(diào)心室HMGCR，并在一定程度上促進(jìn)心室肌TSHR的表達(dá)、上調(diào)心室肌細(xì)胞分泌BNP，在甲減相關(guān)性心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。而目前對(duì)SCH的研究報(bào)道中普遍發(fā)現(xiàn)TSH受體功能缺失或者等位基因失活性突變是引起SCH的主要原因。但是結(jié)合本文實(shí)驗(yàn)研究推測(cè)：是否可能存在其他的作用機(jī)制，即在SCH患者中，TSH的增加所導(dǎo)致的TSH受體的增加不僅可能存在受體功能缺失型變異，也有可能是受體密度或數(shù)量的增加，高濃度的TSH與心肌組織中增加的TSH受體結(jié)合從而影響心臟的功能。因此，對(duì)增加的TSH受體活性的測(cè)定以及結(jié)合后如何影響心肌組織的作用機(jī)制方面將是我們進(jìn)一步研究和探索的方向。

4 結(jié)論

當(dāng)發(fā)生亞臨床甲狀腺功能減退時(shí)，高濃度的TSH可通過(guò)與心室肌組織中高表達(dá)的TSHR結(jié)合并影響心臟舒縮功能。