李 晟，李焱鑫，Emmanuel Mfotie Njoya，蔣 黎，李 霖*，王 飛*

1中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所天然產(chǎn)物及臨床轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041； 2四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所，成都 610072

吲哚胺-2,3-雙加氧酶1(indoleamine 2,3-dioxygenase 1,IDO1)是廣泛分布于肝臟以外，含亞鐵血紅素的單體蛋白質(zhì)，能夠催化色氨酸沿著犬尿氨酸途徑(kynurenine pathway，KP)代謝的限速酶，可催化色氨酸分解產(chǎn)生L-犬尿氨酸、喹啉酸等具有生物活性的代謝產(chǎn)物[1]。IDO1由IDO1基因編碼，IDO1基因啟動(dòng)子含有2個(gè)IFN-γ激活位點(diǎn)[2]，IFN-γ可以誘導(dǎo)IDO1高水平表達(dá)。有研究表明，IDO1在多數(shù)組織中處于沉默狀態(tài)，但是在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[3]，IDO1的過(guò)表達(dá)與癌癥的發(fā)展和預(yù)后相關(guān)[4]，抑制IDO1活性在腫瘤疾病的治療中有著舉足輕重的作用，因此IDO1也被認(rèn)為是一個(gè)具有極大開(kāi)發(fā)潛力的靶標(biāo)。

目前，已經(jīng)進(jìn)入抗腫瘤臨床試驗(yàn)的IDO抑制劑主要包括INCB024360、NLG-919、1-甲基-色氨酸等[5]，但是現(xiàn)有抑制劑存在活性低、選擇性差、分子骨架單一或毒副作用等缺點(diǎn)[6]，世界上還未有IDO1抑制劑藥物問(wèn)世。作為免疫治療的熱門(mén)靶點(diǎn)，IDO1抑制劑的類(lèi)型和數(shù)量都處于一個(gè)很低的水平，IDO1及其抑制劑仍然有巨大的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。

瑞香素(Daphnetin)是從瑞香屬植物長(zhǎng)白瑞香(Daphne Korean Nakai)中提取出來(lái)的有效成分，又名祖師麻甲素，其為我國(guó)首創(chuàng)的新藥，化學(xué)名為7,8-二羥基香豆素(7,8-dithydroxycoumarin)，為香豆素類(lèi)化合物，主要存在于瑞香科屬植物中。臨床上瑞香素主要用于血栓閉塞性脈管炎、冠心病心絞痛、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病[7]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，瑞香素也具有抗腫瘤作用[8]，但是其作用機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。另外，噁唑類(lèi)小分子在天然產(chǎn)物和有機(jī)合成化合物中廣泛存在，具有該基團(tuán)的小分子表現(xiàn)出一系列重要的生物活性，包括抗腫瘤、抗真菌、抗炎和抗病毒等，受到了學(xué)界和業(yè)界的廣泛關(guān)注[9]，但是該類(lèi)化合物發(fā)揮其活性的作用靶點(diǎn)和機(jī)制還尚不清楚。本研究參考文獻(xiàn)[10]報(bào)道的檢測(cè)IDO1代謝色氨酸吸光光度法，利用HeLa細(xì)胞建立體外篩選IDO1小分子抑制劑模型，并通過(guò)過(guò)表達(dá)IDO1和Western blot等方法，評(píng)價(jià)篩選到的小分子化合物IDO1抑制活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)了瑞香素和ZH-26具有抑制IDO1的活性，不但為了解瑞香素這一天然來(lái)源臨床藥物的抗腫瘤機(jī)制提供新的視角，也為開(kāi)發(fā)新的靶向IDO1的腫瘤免疫治療候選藥物奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒

人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人胚腎細(xì)胞HEK-293A購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心，由中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所天然產(chǎn)物中心實(shí)驗(yàn)室保存；IDO cDNA購(gòu)自北京義翹神州科技有限公司。

1.2 試劑

瑞香素(Daphnetin)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；Epacadostat購(gòu)自上海藍(lán)木化工有限公司；人干擾素IFN-γ購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司；IDO1兔多抗、GAPDH兔多抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑LIPOFECTAMINE 2000購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；EasySeeWestern Blot Kit發(fā)光液購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；增強(qiáng)型CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 試劑

Verioskan Flash多功能讀數(shù)儀(Thermo Fisher)；ImageQuantLAS500一體化成像儀(GE Healthcare)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人胚腎細(xì)胞HEK-293A均在DMEM-高糖培養(yǎng)基(10%新生牛血清，100 U/mL氨芐青霉素及100 mg/mL鏈霉素)，5% CO2，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 IDO1抑制劑篩選

HeLa細(xì)胞按1.0×105個(gè)/孔接種至48孔板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。每孔加入適量待測(cè)試藥物，Epacadostat作為陽(yáng)性對(duì)照藥，培養(yǎng)24 h。每孔加入 50 ng/mL IFN-γ培養(yǎng)24 h以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)IDO產(chǎn)生。取100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液至離心管中，加入25 μL 30%的TCA，50 ℃水浴30 min，10 000 rpm離心10 min，取100 μL上清液至96孔板中，每孔加入100 μL 2%的對(duì)二甲氨基苯甲醛(PDAB)，混勻后室溫靜置10 min，多功能讀數(shù)儀檢測(cè)A492。

2.3 免疫印跡分析

HeLa細(xì)胞按1.0×106個(gè)/孔接種至6孔板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。每孔加入不同濃度瑞香素或ZH-26，Epacadostat作為陽(yáng)性對(duì)照藥，培養(yǎng)24 h。每孔加入 50 ng/mL IFN-γ培養(yǎng)24 h以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)IDO產(chǎn)生。吸去培養(yǎng)基，PBS漂洗細(xì)胞3次，加入適量RIPA裂解液，冰浴30 min裂解細(xì)胞，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，12 000 rpm離心，收集上清液為蛋白提取液。加入5×loading buffer沸水浴5 min，制得蛋白樣品。12% SDS-PAGE電泳分離蛋白，用半干法將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，放入TBST配置的5% BSA中封閉2 h。封閉后膜與一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜，用TBST漂洗3次，與HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000稀釋)在室溫孵育2 h后，TBST漂洗3次，按照EasySee Western Blot Kit發(fā)光液說(shuō)明書(shū)進(jìn)行顯色，通過(guò)GE Health成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。

2.4 HEK-293A過(guò)表達(dá)IDO

HEK-293A細(xì)胞按1.0×106個(gè)/孔接種至6孔板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。在轉(zhuǎn)染前2 h將培養(yǎng)液更換為無(wú)血清無(wú)雙抗培養(yǎng)液。用125 μLOpti-MEM稀釋2.5 μg IDO cDNA，另用125 μL Opti-MEM稀釋5 μL LIPOFECTAMINE2000，輕輕混勻，室溫靜置5 min。將質(zhì)粒稀釋液滴加至稀釋好的轉(zhuǎn)染試劑中，室溫靜置20 min，將混合液滴加至6孔板中，37 ℃培養(yǎng)6 h更換為完全培養(yǎng)基，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h過(guò)表達(dá)IDO。

2.5 HeLa細(xì)胞增殖

HeLa細(xì)胞按5 000個(gè)/孔接種至96孔板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。加入不同濃度瑞香素或ZH-26，培養(yǎng)24 h，每孔加入10%增強(qiáng)型CCK-8溶液，在37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)0.5～1 h。當(dāng)培養(yǎng)液顏色變黃時(shí)，多功能讀數(shù)儀檢測(cè)450 nm吸光度。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三遍，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，運(yùn)用GraphPad Prism軟件進(jìn)行單因素方差分析(One way-ANOVA)，P<0.05為具有顯著性差異。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 IDO1抑制劑篩選

通過(guò)以上建立的基于IFN-γ誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞高表達(dá)IDO1模型，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室771個(gè)化合物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)化合物瑞香素和ZH-26(圖1)具有顯著的IDO1活性抑制作用。

圖1 化合物瑞香素和ZH-26的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of daphnetin and ZH-26

用不同濃度的瑞香素和ZH-26檢測(cè)對(duì)IFN-γ誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞表達(dá)IDO1酶抑制作用，采用GraphPad Prism軟件對(duì)IC50值進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果如圖2所示。其中瑞香素的IC50值為16.50 ± 0.33 μM，ZH-26的IC50值為4.68 ± 0.21 μM，說(shuō)明這兩個(gè)化合物在體外具有良好的IDO1酶抑制作用。

圖2 瑞香素和ZH-26對(duì)IFN-γ誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞表達(dá)IDO1酶抑制的IC50值Fig.2 The IC50 value of daphnetin and ZH-26 inhibiting the expression of IDO1 in HeLa cells induced by IFN-γ

3.2 HEK-293A過(guò)表達(dá)IDO1

IDO1在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而在多數(shù)細(xì)胞之中處于沉默狀態(tài)。在HEK-293A中過(guò)表達(dá)IDO1，檢測(cè)瑞香素和ZH-26對(duì)IDO1酶的抑制作用。pCMV3-IDO1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK-293A細(xì)胞24 h后，加入不同濃度的瑞香素和ZH-26處理6 h，細(xì)胞上清液檢測(cè)IDO1活性，結(jié)果如圖3所示，瑞香素和ZH-26均能夠抑制過(guò)表達(dá)的IDO1酶活性，并且隨著濃度增加該抑制作用加強(qiáng)。以上結(jié)果表明，瑞香素和ZH-26可以直接抑制IDO1的活性。

3.3 IDO1的免疫印跡

不同濃度的瑞香素和ZH-26處理HeLa細(xì)胞，Western blot檢測(cè)IDO1蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖4所示。50 ng/mL的IFN-γ可以促進(jìn)IDO1蛋白顯著表達(dá)，而瑞香素可以明顯地抑制IFN-γ上調(diào)IDO1的作用，并且隨著化合物濃度的增加，抑制作用越明顯，但是ZH26則對(duì)IDO1的表達(dá)沒(méi)明顯的作用。以上結(jié)果表明，瑞香素抑制IDO1活性很有可能是通過(guò)下調(diào)IDO1的表達(dá)。

3.4 HeLa細(xì)胞增殖

為了排除化合物對(duì)HeLa細(xì)胞中IDO1的抑制活性是由于其細(xì)胞毒所導(dǎo)致，我們進(jìn)一步分別用不同濃度的瑞香素和ZH-26處理HeLa細(xì)胞24 h，CCK-8檢測(cè)化合物對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如圖5所示。在低濃度下，瑞香素和ZH-26對(duì)HeLa細(xì)胞均沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒作用，表明在低濃度的條件下，化合物下調(diào)HeLa細(xì)胞的IDO1的表達(dá)并不是因?yàn)閷?duì)細(xì)胞的毒性作用引起的。

圖3 瑞香素和ZH-26在過(guò)表達(dá)細(xì)胞中抑制IDO1活性Fig.3 Daphnetin and ZH-26 inhibit IDO1activity in overexpressed cells

圖4 瑞香素和ZH-26下調(diào)IDO1表達(dá)Fig.4 Daphnetin and ZH-26 down regulated the IDO1 expression

圖5 瑞香素和ZH-26對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖作用Fig.5 Inhibition of cell proliferation by daphnetin and ZH-26 in HeLa cells

4 結(jié)論

由于IDO1在腫瘤的發(fā)生轉(zhuǎn)移以及腫瘤免疫耐受過(guò)程起到重要的作用，IDO1被證實(shí)是抑制惡性腫瘤形成，提高免疫治療效果的重要靶點(diǎn)[11]，同時(shí)IDO1也與阿茲海默病、抑郁癥等多種疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[12]，因此IDO1抑制劑的開(kāi)發(fā)具有十分廣闊的前景。

目前，已有大量關(guān)于IDO1抑制劑的相關(guān)報(bào)道，部分抑制劑進(jìn)入了臨床研究階段，但仍存在活性低、選擇性差、分子骨架單一或毒副作用等缺點(diǎn)。1-甲基色氨酸(1-MT)是一個(gè)以色氨酸為模板化學(xué)合成的IDO1競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，其對(duì)IDO1的抑制活性并不高(Ki = 19～35 μM)[13]。INCB024360也是臨床中運(yùn)用的測(cè)試藥，細(xì)胞測(cè)試其對(duì)IDO1的IC50為7.1 nM，不能抑制吲哚胺2，3-雙加氧酶-2(Indoleamine 2,3-dioxygenase-2,IDO2)和色氨酸雙加氧酶(tryptophan 2,3-dioxygenase,TDO)，但是INCB024360治療癌癥的同時(shí)也帶來(lái)不小的毒副作用。天然產(chǎn)物是藥物篩選的寶庫(kù)，也是重要來(lái)源之一，針對(duì)天然產(chǎn)物的IDO1抑制劑篩選報(bào)道中，色胺酮的衍生物對(duì)IDO1有抑制活性(Ki50= 180 μM)[14]。基于熒光素酶報(bào)告基因篩選得到的川楝素(Toosendanin)可以下調(diào)IFN-γ誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞IDO1表達(dá)，促進(jìn)NK細(xì)胞對(duì)A549細(xì)胞的殺傷作用[15]。槲皮素(Quercetin)可能通過(guò)抑制IDO1活性，影響色氨酸代謝發(fā)揮抗腫瘤作用[16]。

促炎因子IFN-γ能夠誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞表達(dá)大量的內(nèi)源性IDO，因而在細(xì)胞上清中可以檢測(cè)到犬尿氨酸的含量變化。在HeLa細(xì)胞中，IFN-γ只能誘導(dǎo)IDO1的表達(dá)，不能誘導(dǎo)IDO2或TDO的表達(dá)[16]。以此建立了IDO1小分子抑制劑體外篩選模型，并在實(shí)驗(yàn)室化合物庫(kù)中得到了天然小分子瑞香素和ZH-26兩個(gè)具有潛在抑制IDO1活性的化合物[17]。其中，ZH-26與靶向基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)進(jìn)入臨床 I 期研究的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物CGS 27023A的結(jié)構(gòu)類(lèi)似[18]。

本研究首次發(fā)現(xiàn)瑞香素和ZH-26可以直接抑制IDO1的活性，從而為基于香豆素類(lèi)和噁唑類(lèi)結(jié)構(gòu)開(kāi)展新型IDO1抑制劑的藥物設(shè)計(jì)提供了藥物前體，也為進(jìn)一步了解其生物活性機(jī)制提供了新的思路。瑞香素過(guò)去也被發(fā)現(xiàn)是一種蛋白酶抑制劑，能夠抑制EGFR、PKA和PKC[19]。因此，瑞香素可能通過(guò)抑制EGFR等蛋白激酶進(jìn)而影響干擾素介導(dǎo)的JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)及IDO1表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)瑞香素和ZH-26是新型高效的IDO1抑制劑，在體外可以下調(diào)IFN-γ誘導(dǎo)的IDO1表達(dá)或抑制IDO1的活性，不但為了解瑞香素這一臨床藥物的抗腫瘤機(jī)制提供新的視角，也為開(kāi)發(fā)新的靶向IDO1的腫瘤免疫治療候選藥物奠定了基礎(chǔ)。