張宏慶，張 恬，張學(xué)智，徐文靜，李浩東，劉 盼，張 鵬，宋發(fā)軍

中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物技術(shù)國家民委重點實驗室 武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點實驗室，武漢 430074

石杉堿甲(Huperzine A)是治療老年癡呆癥(Alzheimer’s disease，AD)的臨床藥物，其臨床應(yīng)用一般以口服的固體藥片、膠囊為主，具有高度的選擇性抑制乙酰膽堿酯酶活性和增強腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元的功能，且對多種實驗性記憶損害均有改善作用，具有廣泛的開發(fā)應(yīng)用價值[1-3]。但其藥源植物蛇足石杉(Huperzineserrata)資源匱乏、生長緩慢，且石杉堿甲含量低[4,5]，僅依靠從蛇足石杉獲取石杉堿甲無法滿足市場需求。內(nèi)生菌是具有極大開發(fā)價值的新的石杉堿甲藥源途徑之一[5,6]。目前，已有多株內(nèi)生菌被報道可產(chǎn)石杉堿甲。Dong等[7]從蛇足石杉分離獲得3株產(chǎn)石杉堿甲內(nèi)生真菌，其中木霉菌(Trichodermasp.)L44的石杉堿甲產(chǎn)量最高(37.63 μg/g)。Wang[8]和Zhu[6]等從蛇足石杉的根、莖和葉組織分離獲得9株產(chǎn)石杉堿甲內(nèi)生真菌，其中竹黃菌(Shiraiasp.)Slf14的石杉堿甲的產(chǎn)量為327.8 μg/L，王吉祥通過優(yōu)化培養(yǎng)溫度、接種量、培養(yǎng)基初始pH值、搖床轉(zhuǎn)速等條件，將竹黃菌Slf14的石杉堿甲產(chǎn)量提高至660 μg/L[9]。Su等[10]從蛇足石杉分離獲得石杉堿甲產(chǎn)量為21.0 μg/L的內(nèi)生真菌—纖姿擬青霉(Paecilomycestenuis)YS-13。汪涯等[11]從蛇足石杉分離獲得石杉堿甲產(chǎn)量為80.1 μg/g的黃曲霉(Aspergillusflavus)LF40。

本研究從野生蛇足石杉共分離獲得形態(tài)各異的內(nèi)生真菌60株，通過HPLC和MS檢測各個真菌的發(fā)酵物，發(fā)現(xiàn)只有編號為SNZ-12的菌株可以產(chǎn)石杉堿甲，其石杉堿甲產(chǎn)量約為1.01 mg/L，并結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和18S rDNA序列分析，將SNZ-12菌株初步鑒定為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)。

1 材料與方法

1.1 材料

蛇足石杉植株采集自湖北省恩施州巴東縣。真菌SNZ-12為分離自蛇足石杉的一株內(nèi)生真菌。PDA及PDL培養(yǎng)基的組成和配制參見文獻(xiàn)[12]；石杉堿甲標(biāo)品(B21166；純度≥98%)購自上海源葉生物科技公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純或色譜純。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離和純化

新鮮蛇足石杉用自來水清洗后，分別用0.1%升汞和75%酒精浸泡20 min和5 min，經(jīng)無菌水沖洗后，加入適量生理鹽水，并輕柔研磨成漿，適當(dāng)稀釋并涂布在PDA平板上，25～28 ℃靜置培養(yǎng)。根據(jù)真菌生長情況，將其接至新的PDA平板繼續(xù)培養(yǎng)，并采用菌絲頂端分離法多次純化獲得的單克隆。

1.2.2 石杉堿甲的提取及分析

石杉堿甲的提取及HPLC分析參照[13]：(1)將純化后的菌株接種至100 mL PDL培養(yǎng)基中，28 ℃、150 rpm培養(yǎng)15天，用3層紗布過濾收集菌體，55 ℃烘干并研磨成粉；(2)稱取1.0 g菌粉，經(jīng)0.8%稀硫酸浸泡48 h、超聲輔提30 min后，用氫氧化鈉將其調(diào)至pH=10.0，再用10 mL氯仿抽提，12 000 rpm離心3 min，吸取下層有機相。抽提三次并合并抽提液，65 ℃減壓蒸干，用1 mL色譜級甲醇溶解蒸餾殘余物，并用0.22 μm濾膜過濾后，用于HPLC和MS分析。(3)HPLC初篩條件：ODS-C18反相柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)，流動相為甲醇：水=65∶35；流速為0.5 mL/min，紫外波長設(shè)定為310 nm，柱溫為20 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。HPLC復(fù)篩條件：流動相為甲醇：水=55∶45，其它條件同HPLC初篩條件。根據(jù)石杉堿甲標(biāo)品和真菌樣品的相應(yīng)峰面積比，計算內(nèi)生真菌的石杉堿甲產(chǎn)量。(4)MS分析由中南民族大學(xué)分析測試中心采用Agilent 1100 LC /MSD trap系統(tǒng)完成，色譜柱、流動相、紫外波長、柱溫和進(jìn)樣量同HPLC條件，流速為2 μL/min，電壓為2.2 KV，離子源為ESI+。

1.2.3 菌株SNZ-12的形態(tài)特征觀察及18S rDNA序列分析

將菌株SNZ-12接種于PDA平板， 26 ℃培養(yǎng)6～10天，培養(yǎng)過程中觀察其菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地等特征，并用接種針挑取少量菌絲于載玻片上，制作臨時裝片，在光學(xué)顯微鏡下觀察其菌絲和孢子的形態(tài)特征，并根據(jù)《真菌鑒定手冊》[14]對菌株進(jìn)行初步鑒定。

以菌株SNZ-12的基因組DNA為模板，采用引物18S-F1(5′-GATCCTGCCAGTAGTCATATGC-3′)和18S-ITS2(5′-GCTGCGTTCATCGATGC-3′)擴增其18S rDNA序列。擴增條件為：96 ℃ 5 min，93 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，68 ℃ 50 s，共30個循環(huán)；然后，68 ℃再反應(yīng)5 min。擴增產(chǎn)物測序后，經(jīng)Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)在線比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)石杉堿甲內(nèi)生真菌的篩選

本研究共分離獲得60株形態(tài)各異的內(nèi)生真菌。采用HPLC初篩條件檢測各個真菌的提取物，發(fā)現(xiàn)只有編號為SNZ-12菌株的提取物(4.277 min)具有與石杉堿甲標(biāo)品(4.279 min)相近的特征峰及其保留時間(Fig.1A、B)；通過改變流動相，采用HPLC復(fù)篩條件再次檢測內(nèi)生真菌SNZ-12提取物，發(fā)現(xiàn)其(8.900 min)依然具有與石杉堿甲標(biāo)品(8.994 min)相近的特征峰及其保留時間(Fig.1C、D)，初步表明內(nèi)生真菌SNZ-12可以產(chǎn)石杉堿甲，其石杉堿甲產(chǎn)量約為1.01 mg/L。之后，對內(nèi)生真菌SNZ-12提取物進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果表明：H+轟擊后，內(nèi)生真菌SNZ-12提取物中含有與石杉堿甲標(biāo)品((M+H)+=243.1)相同的質(zhì)譜特征峰，進(jìn)一步證明生真菌SNZ-12可以產(chǎn)石杉堿甲。

2.2 產(chǎn)石杉堿甲內(nèi)生真菌SNZ-12的鑒定

內(nèi)生真菌SNZ-12于26 ℃條件下在PDA平板上培養(yǎng)7天后，其菌落直徑約為8 cm，初生菌絲為白色，氣生菌絲不發(fā)達(dá)并緊貼培養(yǎng)基(Fig.3A)；菌落背面初為乳白色，隨著培養(yǎng)時間延長逐漸轉(zhuǎn)為淺紫色(Fig.3B)；菌絲光滑無色、分枝、有隔(Fig.3C)；分生孢子無色、多胞、有隔、略彎曲，兩端細(xì)胞稍尖(Fig.3D)。參照《真菌鑒定手冊》[14]發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌SNZ-12與尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)的形態(tài)特征相似。

圖1 石杉堿甲標(biāo)品(A,C)及內(nèi)生真菌SNZ-12提取物(B,D)的HPLC分析Fig.1 HPLC analysis of authentic Huperzine A (A,C) and the extract of endophytic fungus SNZ-12 (B,D)

圖2 石杉堿甲標(biāo)品(A)及內(nèi)生真菌SNZ-12提取物(B)的質(zhì)譜分析Fig.2 Electrospray mass spectra of authentic Huperzine A (A) and the extract of endophytic fungus SNZ-12 (B)

圖3 內(nèi)生真菌SNZ-12的菌落(A,B)、菌絲體(C)和分生孢子(D)的形態(tài)特征Fig.3 Morphological observation of the colony (A),colony reverse(B),hyphae (C) and conidiophores (D) of endophytic fungus SNZ-12 (Magnification with 400×)

內(nèi)生真菌SNZ-12的18S rDNA 序列分析結(jié)果(Fig.4)表明，其與Fusariumoxysporumf.sp.dianthi的 18S rDNA 序列(GenBank no.LT841236.1)、F.oxysporumf.sp.cumini的18S rDNA 序列(GenBank no.LT841208.1)、F.proliferatum的18S rDNA序列(GenBank no.LT841264.1)、Fusariumsp.LL-X4的18S rDNA序列(GenBank no.EF397557.1)分別具有99%的一致性(identity)。結(jié)合內(nèi)生真菌SNZ-12的形態(tài)特征，將其初步鑒定為尖孢鐮刀菌。

圖4 內(nèi)生真菌SNZ-12的18S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 The phylogenetic analysis of the 18S rDNA sequences of endophytic fungus SNZ-12

3 討論

鐮刀菌(Fusariumsp.)是常見植物內(nèi)生真菌之一，分布范圍廣、種類繁多，已報道的鐮刀菌有500多種[15]。目前，已有多篇關(guān)于從蛇足石杉植物分離到鐮刀菌的報道，例如，賀樂等從蛇足石杉分離到一株內(nèi)生鐮刀菌JSM10[16]；孫勇等自蛇足石杉等植物分離到62株內(nèi)生鐮刀菌，分屬6個種，包括尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、串珠鐮刀菌(F.proliferatum)、磚紅鐮刀菌(F.lateritium)、木賊鐮刀菌(F.equiseti)等[17]；韓文霞等從蛇足石杉分離到產(chǎn)石杉堿甲的尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)NSG-1[18]和輪枝鐮孢菌(F.verticillioides)NSH-5[19]；閔長莉等自蛇足石杉中分離到產(chǎn)石杉堿甲的鐮刀菌(Fusariumsp.)WX13[20]。這些結(jié)果表明，鐮刀菌不僅是蛇足石杉的代表性內(nèi)生菌，也是重要的產(chǎn)石杉堿甲內(nèi)生菌資源之一。

根據(jù)文獻(xiàn)報道，尖孢鐮刀菌NSG-1[18]和輪枝鐮孢菌NSH-5[19]在PDL培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)5天后，該菌株的發(fā)酵液(去除菌體的上清液)中石杉堿甲產(chǎn)量分別為11.1 mg/L和117.6 mg/L；這應(yīng)是目前報道的石杉堿甲產(chǎn)量最高的菌株，而且達(dá)到該產(chǎn)量所需的發(fā)酵時間僅為5天，并且石杉堿甲都是分泌在培養(yǎng)基中(該文獻(xiàn)沒有報道菌絲體的石杉堿甲含量)。鐮刀菌WX13在PDB(potato-dextrose broth)培養(yǎng)基培養(yǎng)7天后，收集菌絲體并檢測發(fā)現(xiàn)其含有石杉堿甲，但沒有報道具體產(chǎn)量，也沒有報道發(fā)酵液中是否含有石杉堿甲[20]。本研究分離的尖孢鐮刀菌SNZ-12在PDL培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天時，其菌絲體較少，發(fā)酵液中沒有石杉堿甲；培養(yǎng)15天后，菌絲體中可以檢測到石杉堿甲，產(chǎn)量約為1.01 mg/L，但培養(yǎng)15天的發(fā)酵液(去除菌體的上清液)中依然檢測不到石杉堿甲，說明尖孢鐮刀菌SNZ-12合成的石杉堿甲主要存在于細(xì)胞內(nèi)。通過比較不同產(chǎn)量以及不同石杉堿甲合成特性的鐮刀菌，比如高產(chǎn)且分泌型合成石杉堿甲的尖孢鐮刀菌NSG-1以及產(chǎn)量較低且胞內(nèi)型合成石杉堿甲的尖孢鐮刀菌SNZ-12，有助于揭示不同鐮刀菌的石杉堿甲的合成及調(diào)控機制，而本文所報道菌株為該研究提供了菌種資源。