韓立芬，宋善敏，甘夢(mèng)蘭，王仁鳳，楊再昌

貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴陽(yáng) 550025

結(jié)核(tuberculosis,TB)是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)引起的可侵犯全身各器官的一種慢性傳染病。結(jié)核分為肺結(jié)核和肺外結(jié)核，其中女性盆腔結(jié)核近年來(lái)有增長(zhǎng)的趨勢(shì)[1，2]。女性盆腔結(jié)核是指女性盆腔包括盆腔生殖器官(卵巢、輸卵管、子宮)及盆腔腹膜與子宮周圍的結(jié)締組織的炎癥?；颊呖沙霈F(xiàn)消瘦、疲勞、發(fā)燒、出汗、乏力等癥狀，常伴隨盆腔痛、月經(jīng)異常、痛經(jīng)、閉經(jīng)、月經(jīng)量少等癥狀，是導(dǎo)致女性不孕的重要原因[3-6]。目前，主要使用抗癆藥物對(duì)女性盆腔結(jié)核實(shí)施治療,一線抗結(jié)核藥物缺乏子宮靶向性，必須長(zhǎng)期服藥,由于這類藥物肝毒性明顯,患者往往不能堅(jiān)持服藥,導(dǎo)致治療失敗。因此，研發(fā)子宮靶向性的抗結(jié)核新藥對(duì)盆腔結(jié)核的治療具有重要意義。

益母草是唇形科益母草屬植物益母草(Leonurusartemisia(Laur.)S.Y.Hu F)的新鮮或者干燥地上部分。古代文獻(xiàn)將益母草的功效歸屬于治療婦產(chǎn)科疾病，比如：《本草衍義補(bǔ)遺》說(shuō)“益母草治產(chǎn)前產(chǎn)后諸疾”、《本草綱目》說(shuō)“益母草治婦人胎產(chǎn)諸病”、《本草蒙筌》說(shuō)“益母草總調(diào)胎產(chǎn)諸證”、《本草求真》說(shuō)“益母草消水行血，去瘀生新，調(diào)經(jīng)解毒，為胎前胎后要?jiǎng)?。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，益母草被制成“益母草膏”、“益母草顆?！?、“益母草注射液”等劑型 ，用于治療痛經(jīng)、閉經(jīng)、子宮陰道出血，具有促進(jìn)產(chǎn)后子宮復(fù)舊及清理產(chǎn)后子宮殘留物等功效[7-14]?？梢?，益母草對(duì)子宮及其附件的多種病理過(guò)程具有明顯的干預(yù)作用，那么，益母草是否具有子宮靶向性、是否具有抗子宮結(jié)核的作用？迄今少見相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。

為發(fā)現(xiàn)具有子宮靶向性的抗結(jié)核藥物，我們對(duì)20多種具有治療女性盆腔類疾病的中草藥進(jìn)行了抗結(jié)核桿菌體外試驗(yàn)，部分品種顯示出抗結(jié)核桿菌活性，其中益母草乙醇提取物在改良羅氏培養(yǎng)基中能抑制結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)。對(duì)益母草進(jìn)行抗結(jié)核分枝桿菌活性跟蹤分離，得到活性單體YMC04，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 藥材

益母草(2 700 g)購(gòu)自貴陽(yáng)市和平藥房，為除根外的細(xì)葉益母草全株。

1.2 儀器與試劑

核磁共振數(shù)據(jù)用INOVA400 MHz型超導(dǎo)核磁共振儀測(cè)定，TMS作內(nèi)標(biāo)；質(zhì)譜數(shù)據(jù)用HP-5973型質(zhì)譜儀測(cè)定；柱色譜用硅膠(200～300目)、硅膠H和薄層色譜用硅膠GF254均為青島海洋化工產(chǎn)品；改良羅氏培養(yǎng)基基礎(chǔ)(上海博微生物科技有限公司)，7H9肉湯(Difco)，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 益母草的提取與活性跟蹤分離

1.3.1 益母草的提取與分段

益母草樣品2 700 g用80%的乙醇加熱回流提取三次，每次一小時(shí)，合并提取液，過(guò)濾，置于70℃水浴蒸干，得乙醇提取物浸膏140 g。浸膏用10%乙醇水溶液溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷萃取，得到石油醚部位(45 g)、乙酸乙酯部位(40 g)、二氯甲烷部位(8 g)、剩余物(49 g)，不同萃取部位用改良羅氏培養(yǎng)基絕對(duì)濃度法進(jìn)行活性跟蹤，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯、二氯甲烷萃取部位能抑制結(jié)核桿菌，乙酸乙酯萃取部位活性更強(qiáng)，因此將乙酸乙酯萃取部位視為有效部位。

1.3.2 益母草乙酸乙酯萃取部位的活性跟蹤與分離

乙酸乙酯萃取部位用硅膠柱色譜(200～300目)分離，干法裝柱，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯(4∶1～3∶2)進(jìn)行梯度洗脫，最后甲醇沖柱，經(jīng)TLC檢測(cè)，合并相似成分,得到六個(gè)組分(Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D、Fr.E、Fr.F)(圖1)。利用改良羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行活性跟蹤，發(fā)現(xiàn)有效組分為Fr.C(22-33)。

圖1 益母草乙酸乙酯萃取部位的分離Fig.1 Separation of ethyl acetate extract from Leonurus artemisia (Laur.)S.Y.Hu F

1.3.3 Fr.C的活性跟蹤與分離

Fr.C進(jìn)行硅膠柱色譜(200～300目)分離，用二氯甲烷：甲醇(20∶1～15∶1)作洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，得到四個(gè)組分(Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4)(圖2)。

利用改良羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行活性跟蹤，有效組分為Fr.2。Fr.2經(jīng)硅膠柱色譜多次純化，得到單體YMC04(化合物1，400 mg)。

1.4 抗結(jié)核分枝桿菌測(cè)試絕對(duì)濃度法

改良羅氏培養(yǎng)基 40.84 g，加入12 mL的甘油，加蒸餾水600 mL煮沸5～10 min，115 ℃滅菌 20 min，待冷至55 ℃左右時(shí)以無(wú)菌操作加入1 000 mL無(wú)菌攪勻的全蛋液，混勻，分裝在15 mm×150 mm 的試管，每管5 mL[15]。稱取樣本，用二甲基亞楓(DMSO)溶解，分別加入到含有改良羅氏培養(yǎng)基試管中，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定濃度，每個(gè)濃度做3管，平行做2次，陽(yáng)性對(duì)照為異煙肼(2 μg/mL)，陰性對(duì)照為含5% DMSO的無(wú)藥培養(yǎng)基，放置成斜面，80 ℃下加熱滅菌1 h，隔夜后相同條件下加熱滅菌1 h，冷卻后接種H37Rv菌懸液(108CFU/mL) 20 μL，使菌液由上往下分布在培養(yǎng)基斜面上，置 37 ℃的電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20天。在培養(yǎng)期間，每天觀察記錄一次。結(jié)果判斷：菌落數(shù)低于5個(gè)(含5個(gè))視為有效，其中菌落0～1個(gè)記“+++”，2～4個(gè)記“++”，5個(gè)記“+”，菌落數(shù)在6個(gè)以上(含6個(gè))視為無(wú)效，記“-”。

圖2 Fr.C的分離Fig.2 Separation of Fr.C

2 結(jié)果

2.1 活性跟蹤

采用改良羅氏培養(yǎng)基絕對(duì)濃度法對(duì)益母草乙醇提取物不同萃取部位進(jìn)行活性測(cè)試，結(jié)果見表1，可見活性最強(qiáng)的部位為乙酸乙酯萃取物。

表1 益母草不同萃取部位的活性跟蹤Table 1 Bioassay of different extraction parts of Leonurus artemisia (Laur.)S.Y.Hu F

乙酸乙酯萃取部位經(jīng)硅膠柱色譜分離，得到六個(gè)組分(Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D、Fr.E、Fr.F)，采用改良羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行活性跟蹤，確定Fr.C為活性部位(表2)，其抑制結(jié)核桿菌的MIC值為0.4 mg/mL。

表2 益母草乙酸乙酯部位的活性跟蹤Table 2 Bioassay of ethyl acetate fraction in Leonurus artemisia (Laur.)S.Y.Hu F

Fr.C進(jìn)一步進(jìn)行硅膠柱色譜分離得到活性組分Fr.2，F(xiàn)r.2再經(jīng)硅膠柱色譜反復(fù)純化，得到活性單體化合物1，經(jīng)改良羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行活性測(cè)試，化合物1的MIC值為80 μg/mL。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色針晶(MeOH)；mp.195～196 ℃。1H NMR (400 MHz，CD3OD ) δ (ppm)：7.26 (s,2H),5.07 (s,2H),4.33 (t,J=12 Hz,4 Hz,2H),3.83 (s,6H),3.49 (s,1H),3.38 (dt,J=6 Hz,4 Hz,2H),3.31 (p,J=4 Hz,2H),3.29 (s,1H),3.27 (s,1H),1.86 (m,2H),1.76 (m,2H)。ESI-MS：m/z312 [M+H]+。經(jīng)薄層層析，用改良的碘化鉍鉀顯色呈磚紅色。與益母草堿對(duì)照品經(jīng)TLC檢測(cè)，其Rf值一致，氫譜、質(zhì)譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]對(duì)照基本一致，確定化合物1為益母草堿(圖3)。

圖3 益母草堿結(jié)構(gòu)式Fig.3 Structural formula of leonurine

3 討論

益母草常用于月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)閉經(jīng)，惡露不盡，瘡瘍腫毒等癥，是婦科疾病的常用藥。益母草的化學(xué)成分主要有生物堿(益母草堿、水蘇堿、益母草啶、益母草寧)、黃酮類、二萜類、環(huán)形多肽、阿魏酸等小分子化合物[17]。益母草堿的藥理作用較多，具有舒張冠脈、抑制ATP的合成、抑制炎癥因子的信號(hào)通路、抑制糖異生、促進(jìn)子宮收縮等作用[18]。目前未見益母草堿抗結(jié)核桿菌活性的報(bào)道。

從結(jié)構(gòu)上看，益母草堿(3，5-二甲氧基-4-羥基-苯甲酸 (4-胍基)-1-丁酯)屬于有機(jī)胺類生物堿，含有三個(gè)N原子，與一線抗結(jié)核藥物異煙肼類似，異煙肼同樣含有3個(gè)N原子，一個(gè)N組成吡啶環(huán)，另外兩個(gè)N原子形成肼基，而在益母草堿中，三個(gè)N原子以胍基的形式存在，由此我們推測(cè)，益母草堿抗結(jié)核桿菌機(jī)制可能與異煙肼類似。

在我們的初步試驗(yàn)(尚未報(bào)道)中發(fā)現(xiàn)，益母草堿在大鼠子宮及其附件中的分布大于異煙肼，這一結(jié)果有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)。同時(shí)我們擬對(duì)益母草堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，提高其抗結(jié)核桿菌活性并增加其在子宮中的分布，為治療子宮結(jié)核提供新的線索。