仲金秋,曹玉珠,徐宏江,吳媛媛,張婷婷,李曉曼,陳文星,2,王愛云,2*,陸 茵,2*

1南京中醫(yī)藥大學 江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室；2南京中醫(yī)藥大學 江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心； 3中國藥理學與毒理學研究所 正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司，南京210023

肝損傷是一類嚴重危害人類健康的疾病，是多種肝臟疾病共有的一種病理狀態(tài)，當損傷程度超過其代償能力時，則出現(xiàn)臨床和生化的特征性改變；肝損傷的長期存在往往能夠?qū)е赂卫w維化、肝硬化、甚至肝癌的發(fā)生，因此防治肝損傷是臨床肝病治療的主要環(huán)節(jié)之一[1]。

甘草酸二銨(Diammonium glycyrrhizinate,DG)是由甘草根中提取的成分，在我國應用于治療肝炎已有數(shù)千年的歷史。因其較甘草酸(Glycyrrhizin,GL)穩(wěn)定性更好、溶解度更高且生物活性更強，目前已廣泛應用于臨床[2]。甘草酸二銨具有廣泛的藥理活性，包括抗炎、抗生物氧化、膜保護和免疫調(diào)節(jié)作用，并且具有類固醇類激素的作用等；口服攝入后，甘草酸二銨代謝為甘草酸，然后在腸道菌群的作用下水解成甘草次酸(Glycyrrhetinic acid,GA)：18α-甘草次酸(18α-Glycyrrhetinic acid,18α-GA)和18β-甘草次酸(18β-Glycyrrhetinic acid,18β-GA)，由腸道吸收。研究表明，18α-GA在肝臟和十二指腸中的濃度明顯高于18β-GA，是保肝和抗炎作用中的主要有效成分[3]。

甘草酸二銨廣泛應用于臨床肝病治療，但目前對于其保肝機制研究報道并不多。本研究首次采用Con A誘導的小鼠肝損傷模型研究甘草酸二銨的保肝作用，并利用分子生物學手段探索其可能的作用機制，為其在臨床的應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

SPF級雄性ICR小鼠60 只，18～20 g，上海杰思捷實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2013-0006，動物合格證號：2010002607994。

SPF級雄性WISTAR大鼠20 只，180～220 g，揚州大學比較醫(yī)學中心，許可證號：SCXK(蘇)2012-0004，動物合格證號：NO.201613691。

1.2 藥物

甘草酸二銨腸溶膠囊(江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司)；水飛薊素膠囊(德國馬博士大藥廠)；雙環(huán)醇片(北京協(xié)和藥廠)；刀豆蛋白(sigma)；雙環(huán)醇(中檢所)；18α-GA(江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司，TQ0813-s03)；水飛薊賓(上海源葉生物科技有限公司)；18β-GA(≥98%)和苦參堿(≥98%)購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 試劑

谷草轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒(IFCC法)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒(IFCC法)(日本和光純藥工業(yè)株式會社)；活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)、B淋巴細胞瘤-2基因編碼蛋白(BCL-2)、BCL2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,BAX)、多腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)、γ-干擾素(IFN-γ)抗體(美國Cell Signaling Technology 公司)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)、羊抗兔IgG(H+L)-HRP抗體(巴傲得生物科技有限公司)；轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、環(huán)氧合酶-1(COX-1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)抗體(Abcam公司)；白細胞介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-α)(萬類生物科技有限公司)、白細胞介素-10(IL-10)(美國Affinity Biosciences公司)。

1.4 儀器

臺式冷凍離心機(美國Beckman公司，Allegra 30R)；石蠟包埋儀(德國LEICA公司，EG 1150H+C)；石蠟切片機(德國LEICA公司，RM2245)；全自動生化分析儀(HITACHI，日立7020)；體視熒光顯微鏡(德國 LEICA 公司，M205FA)；恒溫培養(yǎng)箱(上海篤特科學儀器有限公司，HWP-9162)；凝膠電泳儀(來自美國Bio-Rad，Mini Protean 3 Cell)；凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司，ChemiDocTMXRS+)。

2 實驗方法

2.1 小鼠模型的給藥與制備

實驗小鼠適應性飼養(yǎng)5 天后，稱重，隨機分為5 組，每組12 只，分別為空白組(Control)，模型組(Con A)，甘草酸二銨組(DG)，水飛薊素對照組(Silymarin)，雙環(huán)醇對照組(Bicyclol)。甘草酸二銨、水飛薊素和雙環(huán)醇的臨床給藥劑量，分別為450、280和75 mg/d，按體表面積折算的等效劑量比值(小鼠臨床等效劑量=臨床日用藥量(0.0026/0.02)計算藥物的臨床等效劑量，分別為58.5、36.4、9.75 mg/kg。各治療組小鼠分別灌胃給藥，給藥體積為0.1 mL/10 g；空白組和模型組給予等體積生理鹽水。連續(xù)給藥7 天，并稱重。

第8 天，小鼠稱重，實驗組按尾靜脈單次注射Con A 30 mg/kg的藥物劑量，給藥體積為0.05 mL/10 g(Con A溶解于無菌生理鹽水中，濃度為6 mg/mL)；空白組采用同體積生理鹽水處理。其后所有小鼠禁食不禁水。

2.2 小鼠處理

造模8 h后，小鼠眼眶后靜脈叢采血，每只小鼠收集血液1～1.5 mL，于室溫靜置1 h后，4 ℃過夜。全血離心(2 500 rpm，10 min，4 ℃)后取上層血清保存待用。解剖小鼠，分離肝、脾、胸腺后立即用生理鹽水沖洗并稱重。計算動物的各臟器指數(shù)，臟器指數(shù)=(臟器質(zhì)量/體質(zhì)量)×100。每只小鼠取肝臟同一葉浸泡于4%多聚甲醛中固定過夜，后用于組織病理學檢查和免疫組織化學分析。剩余部分肝臟放入-80 ℃冰箱冷凍保存，用于Western blot分析。

2.3 蛋白免疫印跡實驗(Western blot)

稱取50 mg肝組織中于玻璃勻漿器中，加入1 mL RIPA后置于冰上充分研磨，離心取上清液，采用BCA試劑盒進行蛋白含量測定。蛋白變性后-80 ℃冰箱保存。配制10%聚丙烯酰胺凝膠，每孔50 μg蛋白上樣。電泳條件為40 mA，120 min，轉(zhuǎn)膜條件為100 V，90 min。一抗BAX、BCL-2、PARP、IFN-γ、GAPDH、COX-2、cleaved Caspase-3、TGF-β1、COX-1、IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10的稀釋比例均為1∶1 000。使用凝膠成像儀進行成像并利用Photoshop軟件進行蛋白條帶灰度分析。

2.4 小鼠肝組織病理學檢查

肝臟組織在4%多聚甲醛中固定后，后依次進行常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片烤片(4 μm)、HE染色。顯微鏡下(200×)觀察組織病理變化并拍照。

2.5 免疫組織化學

將肝組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，抗原修復，封閉，cleaved Caspase-3(1∶200)、COX-2(1∶200)或Caspase-1(1∶500)4 ℃孵育過夜，滴加二抗，DAB顯色，蘇木精復染。顯微鏡下(200×)拍照，每組選取肝組織切片中9個互不重疊的視野，采用Image Pro Plus 6.0軟件進行圖像分析。

2.6 藥物與轉(zhuǎn)氨酶異常大鼠血清共孵育實驗

2.6.1 收集大鼠AST、ALT水平異常的血清

WISTAR大鼠適應性飼養(yǎng)7 天。第8 天稱重，復制Con A誘導的大鼠肝損傷模型，方法同2.1。造模8 h后，通過腹腔注射10%的水合氯醛麻醉大鼠，隨后采用腹主動脈取血，分離血清。

2.6.2 藥物與大鼠血清共孵育[4]

配制各藥物濃度為18α-GA(11、22、44、88 μg/mL)、18β-GA(11、22、44、88 μg/mL)；水飛薊賓對照組(7.5、15、30、60 μg/mL)；雙環(huán)醇對照組(2.5、5、10、20 μg/mL)；苦參堿(10 μg/mL)，均用DMSO溶解，pH7.2～7.4。取各濃度藥物1 μL與AST、ALT異常升高的血清200 μL混勻，于37 ℃分別孵育0、2、4、6、8、10、12 h。一式3份。各藥物終濃度如下：18α-GA(55、110、220、440 ng/mL)、18β-GA(55、110、220、440 ng/mL)、水飛薊賓(37.5、75、150、300 ng/mL)、雙環(huán)醇(12.5、25、50、100 ng/mL)、苦參堿(50 ng/mL)。差值計算公式：Normalized(AST)=AST-AST control；Normalized(ALT)=ALT-ALT control。

2.7 血清轉(zhuǎn)氨酶活性檢測

采用HITACHI 7020全自動生化分析儀，按廠家試劑盒說明書設置參數(shù)后檢測血清中AST和ALT水平。

2.8 統(tǒng)計學方法

3 實驗結(jié)果

3.1 甘草酸二銨對肝損傷小鼠的體質(zhì)量和臟器指數(shù)的影響

如表1、表2所示，各組小鼠體質(zhì)量無顯著差異，但模型組小鼠肝臟、脾臟和胸腺內(nèi)臟指數(shù)較空白組顯著增加(P<0.001或P<0.05)，而且肉眼可見小鼠肝臟、脾臟和胸腺腫大，肝臟外表面充血。而58.5 mg/kg甘草酸二銨能夠顯著降低Con A 誘導的小鼠肝臟指數(shù)異常(P<0.05)；36.4 mg/kg水飛薊素對小鼠的臟器指數(shù)沒有影響；9.75 mg/kg雙環(huán)醇能改善刀豆蛋白引起的小鼠脾臟臟器指數(shù)異常(P<0.05)。

3.2 甘草酸二銨對肝損傷小鼠的組織病理學和血清生化指標的影響

凋亡、炎癥是Con A誘導急性肝損傷的重要病理機制。肝組織HE染色結(jié)果顯示，空白組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列。模型組肝臟匯管區(qū)正常結(jié)構(gòu)被明顯破壞，細胞邊界不清，胞漿呈絮狀，部分細胞核縮小，炎性細胞浸潤(圖1A中箭頭所指)。各給藥組肝小葉輪廓較模型組清晰，細胞形態(tài)相對完整，部分可見輕度病變，肝細胞索排列整齊，肝組織病理學形態(tài)得到改善(圖1A)。此外，我們還對空白組、模型組和甘草酸二胺組小鼠肝組織切片進行了凋亡蛋白、炎癥介質(zhì)的免疫組化染色。結(jié)果顯示，模型組小鼠肝組織中cleaved Caspase-3的表達顯著增加(P<0.01)，而58.5 mg/kg甘草酸二銨能夠下調(diào)肝組織中cleaved caspase-3的水平(圖1B)。同時，模型組小鼠肝組織中Caspase-1和COX-2的表達升高(P<0.001)。而58.5 mg/kg甘草酸二銨能夠降低caspase-1以及COX-2的表達(P<0.01)(圖1C)。

表1 甘草酸二銨對Con A所致肝損傷小鼠體質(zhì)量的影響Table 1 Effect of DG on the body weight of

注：與空白組比較沒有差異；與模型組比較沒有差異。
Note:Compared with control group,no significant difference；compared with Model group,no significant difference.

表2 甘草酸二銨對Con A所致肝損傷小鼠肝臟、脾臟和胸腺臟器指數(shù)的影響Table 2 Effect of DG on the liver,spleen and thymus viscera index of

注：與空白組比較#P<0.05；###P<0.001；與模型組比較*P<0.05。
Note:Compared with control group,#P<0.05;###P<0.001;Compared with Model group,*P<0.05.

血清轉(zhuǎn)氨酶水平的檢測結(jié)果與組織病理學變化結(jié)果相一致。如表3所示，模型組血清中AST和ALT水平顯著升高(P<0.001)，58.5 mg/kg甘草酸二銨能夠降低小鼠血清中AST和ALT水平(P<0.001或P<0.01)；36.4 mg/kg水飛薊素也具有降低小鼠血清中AST和ALT的作用(P<0.05或P<0.001)；但是9.75 mg/kg雙環(huán)醇僅能降低小鼠血清中ALT水平(P<0.05)，而對AST沒有影響。

表3 甘草酸二銨對Con A所致肝損傷小鼠血清ALT和AST水平的影響Table 3 Effects of DG on the serum ALT,AST levels in mice

注：與空白組比較，###P<0.001；與模型組比較，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
Note：Compared with control group,###P<0.001;Compared with Model group,*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001.

圖1 甘草酸二銨對Con A所致肝損傷小鼠的組織病理學的影響(200x)Fig.1 Effects of DG on histopathology in mice with Con A-induced hepatic injury (200x)注：A：不同治療組的肝組織HE染色；B：小鼠肝組織cleaved-Caspase 3的免疫組化分析；C：小鼠肝組織Caspase-1、COX-2的免疫組化分析；(a) 空白組；(b) 模型組；(c) 甘草酸二銨組；(d) 水飛薊素對照組；(e) 雙環(huán)醇對照組；與空白組比較，###P<0.001；與模型組比較，**P<0.01；***P<0.001。Note：A:Liver tissue sections from the different treatment groups were stained with hematoxylin-eosin;B:Immunohistochemistry analysis of cleaved-Caspase 3 expression in mice liver tissues;C:Immunohistochemistry analysis of Caspase-1,COX-2 expression in mice liver tissues;(a) Control group,(b) Model group;(c) DG treatment group;(d) Silymarin treatment group;(e) Bicyclol treatment group;Compared with control group,###P<0.001;Compared with Model group,**P<0.01;***P<0.001.

3.3 甘草酸二銨體外對血清中的AST、ALT水平的影響

如表4和表5所示，陽性對照藥苦參堿(50 ng/mL)在與血清孵育10 h后，能夠降低血清中的AST水平(P<0.001)。18α-GA、18β-GA和雙環(huán)醇不能直接降低血清中的AST、ALT水平。而水飛薊賓(300 ng/mL)在與血清孵育8 h后，能夠降低血清中的ALT水平(P<0.001)。

表4 18α-GA、18β-GA體外對血清中AST活性的影響Table 4 Serum AST activity from serum-18α-GA,18β-GA incubation assay

注：與DMSO組比較，***P<0.001。
Note：Compared with DMSO group,***P<0.001.

表5 18α-GA、18β-GA體外對血清中ALT活性的影響Table 5 Serum ALT activity from serum-18α-GA,18β-GA incubation assay

續(xù)表5(Continued Tab.5)

ALT Change to control濃度Dose(ng/mL)0 h2 h4 h6 h8 h10 h12 h150-4.50±0.75-1.13±0.72-1.73±0.51-0.87±1.42-4.23±0.852.74±2.931.73±1.97300-4.70±1.18-0.77±2.33-2.17±1.50-1.40±1.90-12.46±5.46???-8.90±4.48???-9.47±9.20???雙環(huán)醇Bicyclol12.5-2.64±0.12-1.80±0.26-1.03±0.150.83±0.35-3.13±0.201.97±1.912.27±1.1025-3.64±1.59-1.63±0.76-1.23±1.57-0.47±1.56-2.46±1.292.64±0.800.23±7.8750-2.77±1.91-3.53±0.32-1.57±1.360.23±2.06-2.00±0.151.90±0.862.43±1.27100-3.10±0.06-3.37±0.55-0.33±0.761.23±1.50-0.90±1.994.54±1.460.63±4.19

注：與DMSO組比較，***P<0.001。
Note：Compared with DMSO group,***P<0.001.

3.4 甘草酸二銨對肝損傷小鼠肝細胞凋亡的影響

如圖2所示，模型組小鼠肝組織中BAX/BCL-2顯著升高，同時cleaved Caspase-3、cleaved PARP的表達也顯著上調(diào)(P<0.01或P<0.001)。而58.5 mg/kg甘草酸二銨能降低肝組織中cleaved caspase-3、cleaved PARP、BAX/BCL-2表達水平(P<0.01或P<0.001)。因此推測甘草酸二銨能夠改善Con A致小鼠肝損傷組織的凋亡。

圖2 甘草酸二銨對Con A所致肝損傷小鼠組織中凋亡蛋白的影響Fig.2 Effects of DG on hepatic apoptosis in mice with Con A-induced hepatic injury注：與空白組比較，##P<0.01；###P<0.001；與模型組比較，*P<0.01；***P<0.001。Note：Compared with control group,#P<0.05;##P<0.01;###P<0.001;Compared with Model group,*P<0.05;***P<0.001.

3.5 甘草酸二銨對肝損傷小鼠炎癥反應的影響

如圖3所示，模型組小鼠肝組織中Caspase-1、COX-2、TGF-β1、IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α和IFN-γ的表達升高，COX-1表達下降(P<0.01或P<0.001)。而58.5 mg/kg 甘草酸二銨能夠降低TGF-β1、caspase-1以及COX-2表達水平，上調(diào)COX-1的表達，同時降低IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α和IFN-γ的表達水平(P<0.05、P<0.01或P<0.001)。因此推測甘草酸二銨能夠保護小鼠免受Con A誘導的肝臟組織炎癥反應。

4 討論

Con A經(jīng)尾靜脈單次注射，能夠引起TNF-α、IL-6、IFN-γ和IL-1β等多種細胞因子的分泌，導致肝臟組織炎性細胞浸潤，誘發(fā)炎癥和凋亡，進而導致急性肝損傷[5,6]。該模型與人類肝炎的發(fā)病機理及病理學特征極為相似，能夠很好地模擬臨床自身免疫性肝炎(AIH)、急性病毒性肝炎和藥物中毒引起的肝炎等，因而在保肝藥研究中被廣泛應用[7]。水飛薊素、雙環(huán)醇分別為天然和人工合成的常見保肝藥，保肝機制各不相同，在保肝藥的研究中都常被用作陽性對照藥[8,9]。水飛薊素可以通過抗脂質(zhì)過氧化反應維持細胞膜的流動性、從而改善肝功能；還可以中斷肝腸循環(huán)，對抗毒物所致的肝損傷[10,11]。雙環(huán)醇能夠通過清除自由基、抑制氧化應激、保護肝細胞核DNA免受損傷、減輕線粒體損傷，從而發(fā)揮降低血清轉(zhuǎn)氨酶和抗肝損傷、抗肝纖維化以及抗肝炎病毒的活性[12]。因此，本研究并以這兩種保肝藥作為對照藥，通過復制Con A肝損傷模型，檢測肝功能、肝臟病理組織和分子生物學指標來綜合評判甘草酸二銨的肝保護作用，并初步探討其作用機制。

AST、ALT升高是判斷急性肝損傷嚴重程度的重要指標[5]。本研究表明，甘草酸二銨在保護小鼠免受Con A所致肝臟病理損傷的同時，可以降低小鼠血清中AST和ALT水平。人體藥代動力學研究顯示，甘草酸二銨腸溶膠囊口服攝入后，在體內(nèi)被代謝成18α-GA和18β-GA，最高血藥濃度為95.57±43.06 ng/mL[13]。為驗證甘草酸二銨是否會直接降解血清中的AST和ALT，本文以苦參堿為陽性對照藥[4]，進行了藥物-轉(zhuǎn)氨酶異常血清共孵育實驗。結(jié)果表明，18α-GA和18β-GA均不能直接降低血清中AST、ALT水平。因此，我們推測甘草酸二銨是通過保護肝細胞，減少AST、ALT外溢來發(fā)揮降酶作用的。

圖3 甘草酸二銨對Con A所致肝損傷小鼠組織中炎癥因子水平的影響Fig.3 DG inhibited inflammation in mice with Con A-induced hepatic injury注：與空白組比較，##P<0.01；###P<0.001；與模型組比較，*P<0.05；**P<0.01。Note：Compared with control group,##P<0.01;###P<0.001;Compared with Model group,*P<0.05;**P<0.01.

BAX與BCL-2是一對互相拮抗的凋亡相關(guān)蛋白，BAX/BCL-2的比值決定凋亡的啟動，進而激活細胞凋亡下游的Caspase-3，而PARP剪切是Caspase-3激活的指標[14]。本研究結(jié)果顯示，甘草酸二銨下調(diào)肝損傷小鼠肝臟中BAX/BCL-2的比值，抑制小鼠肝組織中凋亡蛋白PARP、cleaved Caspase-3的表達，說明甘草酸二銨具有抑制肝細胞凋亡的作用。在Con A誘導的肝損傷中，Caspase-1可以調(diào)節(jié)pro-IL-1β和pro-IL-18的活化，進而誘導T淋巴細胞增殖[15]。同時也伴隨TGF-β1表達失衡和肝細胞內(nèi)COX-2表達上調(diào)后前列腺素(PGs)的生成[16,17]。本研究結(jié)果表明，甘草酸二銨能抑制Con A所致小鼠肝組織中Caspase-1、TGF-β1、COX-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ等炎性因子的上調(diào)，和COX-1的下調(diào)，顯示其作用機理與抑制抗炎和細胞凋亡有關(guān)。

綜上可見，甘草酸二銨腸溶膠囊能夠改善Con A致小鼠肝損傷，并通過保護肝細胞來降低血清AST、ALT水平，其降酶保肝的作用可能與抑制小鼠肝臟組織細胞凋亡以及炎性細胞因子的水平相關(guān)。