李 霽，劉丹丹，周峰旭，李凌晨，納 鑫

昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500

結(jié)腸癌的死亡率位居我國(guó)惡性腫瘤的第三位，結(jié)腸癌治療采用手術(shù)為主，化療為輔的方法進(jìn)行治療。奧沙利鉑(Oxaliplatin,L-OHP)是治療結(jié)直腸癌的一線藥物，已應(yīng)用多年，但因易產(chǎn)生多藥耐藥及發(fā)生末梢神經(jīng)炎而限制了其使用[1，2]。青蒿素為我國(guó)首次從黃花蒿中提取的一種高效低毒的抗瘧藥，研究發(fā)現(xiàn)青蒿素及衍生物除具有抗瘧作用外，還具有抗病毒和抗腫瘤作用。Efferth等[3]對(duì)55個(gè)腫瘤細(xì)胞株研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞對(duì)青蒿素類化合敏感，雙氫青蒿素(Dihydroartemisinin，DHA)為青蒿素類化合物在體內(nèi)的主要活性代謝產(chǎn)物，與其他青蒿素類藥物相比顯示出較強(qiáng)的抗腫瘤活性且毒性較低[4,5]。因此本研究將雙氫青蒿素和奧沙利鉑聯(lián)合應(yīng)用，觀察體外兩藥聯(lián)合對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116增殖和凋亡的影響，為雙氫青蒿素抗腫瘤的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

雙氫青蒿素(Fluka公司，美國(guó))；奧沙利鉑(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，中國(guó))；RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO公司，美國(guó))；胎生牛血清(GIBCO公司，美國(guó))；二甲基亞砜(Amresco公司，美國(guó))；二甲基四氮唑藍(lán)(Amresco公司，美國(guó))；十二烷基硫酸鈉(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司，中國(guó))；異丁醇(上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn)，中國(guó))；濃鹽酸(成都市欣海興化工試劑廠，中國(guó))；Annexin V-FITC(欣博盛公司，中國(guó))；Bax、Bcl-2抗體(Abcom公司，英國(guó))。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司，美國(guó)；型號(hào)Plus384)；倒置顯微鏡(OLYMPUS公司，日本；型號(hào)CKX31)；流式細(xì)胞儀(Beckman公司，美國(guó)；型號(hào)Coultet FCS500)；CO2培養(yǎng)箱(Hereaus公司，德國(guó)；型號(hào)3111.REL#5)

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

HCT116細(xì)胞(Hunman colon tumor-116)保存于云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，于10%新生牛血清RPMI1640培養(yǎng)液中，5% CO2，37 ℃孵育培養(yǎng)。

1.4 MTT測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率

取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔含細(xì)胞8×103個(gè)，培養(yǎng)12小時(shí)后加入DHA，L-OHP，每組樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，空白對(duì)照組加入等體積的AS，溶媒對(duì)照組0.5%DMSO。48小時(shí)后，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL,于37 ℃繼續(xù)孵育4 h終止培養(yǎng)，加入三聯(lián)液100 mL，過(guò)夜后比色，選擇570 nm和630 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，在酶聯(lián)檢測(cè)儀雙波長(zhǎng)法上測(cè)定每孔吸光度(OD)，記錄結(jié)果。抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD/空白組OD)×100%。

1.5 聯(lián)合用藥藥效評(píng)價(jià)

采用金正均Q值法分析兩藥聯(lián)合效應(yīng)，公式Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)，其中Ea、Eb表示a、b兩藥單獨(dú)作用時(shí)的細(xì)胞抑制率，Ea+b表示兩藥聯(lián)合作用時(shí)的細(xì)胞抑制率，式中分母表示“期望合并效應(yīng)”，分子表示“實(shí)測(cè)合并效應(yīng)”，Q值為二者的比值，Q<0．85表示兩藥聯(lián)用為拮抗作用，0.85≤Q≤1.15為相加作用，Q>1.15為協(xié)同作用。

1.6 AnnexinV-FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡

藥物作用48小時(shí)后，用0.5%胰酶消化細(xì)胞，各組樣本細(xì)胞用冷PBS洗滌二次，并在染色緩沖液中以1×106細(xì)胞/ml的濃度重懸。吸取100 μL的細(xì)胞至試管中，加入適量熒光標(biāo)記的Annexin-V和PI。按照說(shuō)明書提示濃度操作，混勻后避光室溫下孵育10 min。孵育后加入300 μL染色緩沖液，立即上流式細(xì)胞儀分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 caspase-3，caspase-8活性檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116細(xì)胞，用DHA(10 μmol/L) ，L-OHP(0.02 μmol/L) ，DHA(10 μmol/L) +L-OHP(0.02 μmol/L)聯(lián)合，設(shè)定空白對(duì)照組，分別誘導(dǎo)24 h后，收集細(xì)胞。加入100 μL 裂解緩沖液，渦旋振蕩。然后置于冰上15 min，每5 min 渦旋振蕩一次。在4 ℃，500×g下離心5 min，取上清液。對(duì)上清液用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。取10 μmol/L(大約含20～50 μg) 蛋白的上清液，加入90 μL檢測(cè)緩沖液和10 μL Ac-DEVD-pNA，在37 ℃避光反應(yīng)1～2 h，出現(xiàn)黃色時(shí)檢測(cè)其活性。在酶標(biāo)儀上選擇450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。根據(jù)凋亡誘導(dǎo)的細(xì)胞的吸光度與空白對(duì)照細(xì)胞的吸光度的比值計(jì)算相對(duì)的caspase-3，caspase-8 的活性程度。

1.8 Western blot分析

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按試驗(yàn)要求處理后，收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，加入細(xì)胞裂解液，100 μL,14 000 rpm離心10 min，蛋白定量，取40 μg蛋白加入上樣緩沖液，95 ℃下10 min。l0%的聚丙烯酰胺SDS凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，5%脫脂牛奶封閉后依次加入第一、二抗體，室溫下孵育2 h，TBST緩沖液洗滌3次，加入化學(xué)發(fā)光劑，放人暗盒中并壓片，2～5 min后顯影、定影。

1.9 單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

(1)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞，接種于六孔板中，接種密度為5×105個(gè)/孔。CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。重懸于冷PBS中，并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×103個(gè)/mL，置于冰上待用。(2)制備1%常溫熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠，將凝膠涂布于載玻片上，涂布厚度約為0.5 mm，并將制備好的凝膠置于4 ℃冰箱中冷卻凝固。同時(shí)制備1%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠，最后再在上層涂布一層常溫熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠，形成一個(gè)“三明治凝膠”。加入0.5X TBE 電泳緩沖液，30 V ,電泳15 min。最后置于Du red染色液中染色1 h，置于熒光顯微鏡下，采用CASP彗星分析軟件分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 DHA與L-OHP聯(lián)合對(duì)HCT116人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用

L-OHP與DHA單獨(dú)和聯(lián)合使用對(duì)HCT116人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用，單獨(dú)使用L-OHP或DHA對(duì)HCT116細(xì)胞均具有明顯的增殖抑制作用，并具有一定的量效關(guān)系。在DHA10 μmol/L與L-OHP 0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 μmol/L濃度對(duì)HCT116人結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用，結(jié)果顯示其抑制率分別達(dá)到49.39%、64.99%、73.48%、75.21%、77.49%，比兩藥單獨(dú)使用抑制率顯著提高，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(**P<0.01)(見(jiàn)表1)。

2.2 金正均Q值進(jìn)行聯(lián)合用藥作用分析

DHA在10 μmol/L濃度下，L-OHP在0.01 μmol/L、0.02 μmol/L、0.04 μmol/L濃度下Q>1.15，兩藥聯(lián)合應(yīng)用可表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用。而DHA在10 μmol/L濃度，L-OHP在0.08 μmol/L、0.16 μmol/L濃度下Q值在0.85～1.15之間，兩藥聯(lián)合應(yīng)用表現(xiàn)出相加作用(見(jiàn)表1)。

表1 DHA、L-OHP及聯(lián)合用藥對(duì)HCT116細(xì)胞的抑制率Table 1 Inhibitory effects of DHA and L-OHP and combination on HCT116

注：與10 μmol/L DHA組比較*P<0.05；**P<0.01。與同濃度的L-OHP組比較,#P<0.05；##P<0.01。Q<0.85表示兩藥聯(lián)用為拮抗作用，0.85≤Q≤1.15為相加作用，Q>1.15為協(xié)同作用。
Note:Compared with 10 μmol/L DHA group*P<0.05;**P<0.01.Compared with the same concentration of L-OHP group,#P<0.05;##P<0.01.Q<0.85 indicates that the two drugs are combined for antagonism,0.85≤Q≤1.15 for additive effect,and Q>1.15 for synergistic effect.

2.3 DHA與L-OHP聯(lián)合應(yīng)用對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的影響

DHA與L-OHP單獨(dú)和聯(lián)合作用于結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 48小時(shí)后，對(duì)照組凋亡率為3.91%；DHA組在10 μmol/L濃度下凋亡率為19.14%；L-OHP組在0.02 μmol/L濃度下凋亡率為27.31%；兩藥聯(lián)合組凋亡率為35.52%比DHA組和L-OHP組均較高，(**P<0.01)(見(jiàn)圖1)。

2.4 Western-blot檢測(cè)Bcl-2及Bax蛋白

Western-blot檢測(cè)Bcl-2及Bax蛋白，結(jié)果顯示，DHA組、L-OHP 組以及DHA、L-OHP聯(lián)合組作用HCT116細(xì)胞24 h后，檢測(cè)Bcl-2/Bax蛋白變化，DHA 、L-OHP聯(lián)合組與DHA組比較，Bcl-2/Bax降低，**P<0.01 ,DHA 、L-OHP 聯(lián)合組與L-OHP 比較，Bcl-2/Bax降低，(##P<0.01)(見(jiàn)圖2)。

2.5 Caspase-3，Caspase-8 活性檢測(cè)

對(duì)給藥后的Caspase-3，Caspase-8進(jìn)行活性檢測(cè)，結(jié)果顯示，DHA組、L-OHP組以及DHA、 L-OHP聯(lián)合組作用HCT116細(xì)胞24h后，DHA、L-OHP 聯(lián)合組的Caspase-3 活性顯著提高，與DHA組和L-OHP組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.01。DHA組、L-OHP 組以及DHA、L-OHP 聯(lián)合組作用HCT116細(xì)胞24 h后Caspase-8顯著提高，與DHA組及L-OHP組比較DHA、L-OHP聯(lián)合組caspase-8顯著提高與L-OHP組比較P<0.05，與DHA組比較P<0.01(見(jiàn)圖3)。

圖1 DHA 與L-OHP聯(lián)合對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effect of DHA combined with L-OHP on apoptosis of HCT116 cells注：與DHA組比較*P<0.05；**P<0.01，與L-OHP組比較,#P<0.05。Note：Compared with DHA group *P<0.05;**P<0.01,compared with L-OHP group, #P<0.05.

圖2 DHA與L-OHP聯(lián)合對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響Fig.2 Effect of DHA combined with L-OHP on apoptosis-related proteins in HCT116 cells注：與DHA組比較，**P<0.01；與L-OHP組比較，##P<0.01。Note：Compared with DHA group,**P<0.01;compared with L-OHP group,##P<0.01.

2.6 單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

給藥后進(jìn)行單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，DHA組、L-OHP組以及DHA、 L-OHP聯(lián)合組作用HCT116細(xì)胞后，DHA、L-OHP聯(lián)合組的慧尾率顯著提高，與DHA組和L-OHP組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01和P<0.05)(見(jiàn)圖4)。

3 討論

奧沙利鉑是臨床上一線的治療結(jié)直腸癌的抗腫瘤藥物，抗腫瘤作用顯著，但奧沙利鉑長(zhǎng)時(shí)間大量使用會(huì)產(chǎn)生腎毒性、耳毒性、神經(jīng)毒性等毒副反應(yīng)，腫瘤細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的耐藥性產(chǎn)生降低了奧沙利鉑的療效，是目前腫瘤化療失敗的重要原因[6]。因此利用毒性較低的具備抗腫瘤活性的化合物使化療藥物增敏從而減少化療藥物用量是一種提高抗腫瘤藥物化療作用降低毒性的重要方法。青蒿素類藥物毒性小對(duì)包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤有效，有研究報(bào)道其甚至可以逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌的耐藥[7，8],因此本研究將雙氫青蒿素與奧沙利鉑聯(lián)用觀察其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的抑制作用，計(jì)算藥物聯(lián)用是否有協(xié)同效應(yīng)，對(duì)其凋亡及相關(guān)蛋白進(jìn)行研究，為青蒿素類藥物進(jìn)入抗腫瘤的臨床治療提供依據(jù)。

圖3 DHA與L-OHP聯(lián)合用藥對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白活性的影響Fig.3 The effects of DHA and L-OHP on activity of apoptosis-related proteins注：檢測(cè)caspase-3活性，與DHA組比較，**P<0.01；與L-OHP組比較，##P<0.01；檢測(cè)caspase-8活性，與DHA組比較，**P<0.01；與L-OHP組比較，#P<0.05。Note：Detection of caspase-3 activity,compared with DHA group,**P<0.01;compared with L-OHP group,##P<0.01;detection of caspase-8 activity,compared with DHA group,**P<0.01;and Compared with L-OHP group,#P<0.05.

圖4 DHA與L-OHP聯(lián)合用藥對(duì)HCT116細(xì)胞DNA損傷的影響Fig.4 The effects of DNA damage on DHA and L-OHP注：與DHA組比較，**P<0.01；與L-OHP組比較，#P<0.05。 Note：Compared with DHA group,**P<0.01;compared with L-OHP group,#P<0.05.

L-OHP與DHA單獨(dú)和聯(lián)合使用對(duì)HCT116人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖均有抑制作用，聯(lián)合用藥抑制率比兩藥單獨(dú)使用抑制率提高，應(yīng)用金正均Q值法進(jìn)行聯(lián)合用藥分析發(fā)現(xiàn)兩藥聯(lián)合使用在一定濃度下發(fā)揮協(xié)同作用，而在L-OHP相對(duì)較高的濃度下只發(fā)生相加作用。DHA可誘導(dǎo)DNA氧化損傷，而L-OHP抗腫瘤的主要機(jī)制是與腫瘤細(xì)胞DNA形成鏈內(nèi)、外交聯(lián)，影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[9，10]。DHA與L-OHP二者都能通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞的DNA來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用，通過(guò)DNA損傷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在DHA與L-OHP聯(lián)合應(yīng)用后DNA損傷加重，影響腫瘤細(xì)胞的增殖，甚至可能進(jìn)一步引起細(xì)胞凋亡。

觀察DHA與L-OHP聯(lián)合應(yīng)用對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡作用發(fā)現(xiàn)，與單藥組比較兩藥聯(lián)合應(yīng)用凋亡率顯著提高，有研究顯示DHA能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡并對(duì)多種腫瘤有殺傷作用[11，12],研究表明DHA與順鉑聯(lián)用可提高抗腫瘤細(xì)胞的作用[13]，L-OHP也可引起多種腫瘤細(xì)胞凋亡，并且可通過(guò)Fas/FasL和caspase-8誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14，15]。凋亡是多基因多因素相互之間影響和調(diào)控的結(jié)果。Bcl-2 基因是重要的凋亡抑制基因,Bcl-2 /Bax比值決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡狀態(tài)，若Bax越高，Bcl-2就被抑制，細(xì)胞凋亡被誘導(dǎo),反過(guò)來(lái)Bax受抑，細(xì)胞得以生存[16]。研究顯示兩藥聯(lián)用Bcl-2 /Bax顯著降低，誘發(fā)凋亡，Bax 是Bcl-2家族成員，其可通過(guò)活化Caspases促進(jìn)凋亡。Caspases 是凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路，其中Caspase-3是核心效應(yīng)器，負(fù)責(zé)對(duì)凋亡途徑最后執(zhí)行階段的全部或部分關(guān)鍵性蛋白的酶切，可引發(fā)瀑布式激活下游的Caspase 蛋白酶家族，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6],本研究結(jié)果顯示兩藥聯(lián)合應(yīng)用可顯著提高Caspase-3的活性，同時(shí)也提高Caspase-8的活性，從而誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素及奧沙利鉑可抑制HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖作用，二者聯(lián)用在一定濃度下可對(duì)HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)揮協(xié)同作用，顯著提高抑制率。同時(shí)可通過(guò)下調(diào)Bcl-2/Bax表達(dá)比值，激活Caspase-3、Caspase-8的活性，促進(jìn)HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。兩藥聯(lián)合可促進(jìn)DNA損傷加重，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，其協(xié)同作用發(fā)生的具體靶點(diǎn)和機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。