張喜峰，陳雨迪，崔 晶，程雯慧

1河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院；2甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室,張掖 734000

鎖陽(CynomoriumsongaricumRupr.)為鎖陽科、鎖陽屬多年生肉質(zhì)寄生草本，國內(nèi)主要分布于新疆、甘肅、內(nèi)蒙、寧夏等地；其含有多糖、皂苷、原花青素、木脂素和生物堿等多種活性物質(zhì)[1-3]；原花青素作為黃酮類化合物一種，由于具有功能強大的活性和保健功效，已引起國內(nèi)外研究人員廣泛關(guān)注，抗氧化和抗糖基化是其最重要功能活性[4,5]；國內(nèi)外研究表明，原花青素可通過清除自由基、螯合金屬離子、抑制蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾等多種作用抑制晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)形成[6,7]。目前，對鎖陽原花青素相關(guān)研究主要側(cè)重離體化學(xué)研究[8]；而采用不同提取方法對鎖陽原花青素生物活性影響的相關(guān)研究較少，尤其對抗糖基化的能力缺乏基礎(chǔ)研究。

活性氧和活性氮自由基可氧化損傷生物體內(nèi)生物大分子，從而誘發(fā)癌癥、衰老、動脈粥樣硬化和糖尿病并發(fā)癥等。在氧氣和過渡金屬的存在下，與高血糖有關(guān)的許多生化途徑通過自氧化產(chǎn)生的自由基損傷蛋白質(zhì)、脂類和核酸，此過程為糖基化過程，即游離氨基與還原糖的醛基之間發(fā)生非酶促反應(yīng)，在高血糖的生理環(huán)境中，導(dǎo)致AGEs形成加速[9]。AGEs和氧化應(yīng)激的過量積累可引起多種細(xì)胞變化，導(dǎo)致宏觀和微血管并發(fā)癥，如動脈粥樣硬化、糖尿病視網(wǎng)膜病變、腎病和神經(jīng)病變等[10]。

據(jù)報道，抗氧化劑和自由基清除劑抑制糖基化過程[11]?？寡趸瘎┛赡苁穷A(yù)防糖尿病并發(fā)癥的有效策略之一[12]。研究表明，具有抗氧化和抗糖基化特性的化合物在治療糖尿病方面更有效[13]。因此，尋找有效抑制AGEs形成的膳食植物和水果已成為研究熱點之一。

因此，本試驗采用甘肅瓜州8月份采收的鎖陽為材料，研究不同提取方法對鎖陽原花青素得率的影響，并對其體外抗氧化、抗糖基化活性進行了比較研究，為鎖陽原花青素的提取和天然糖基化抑制劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鎖陽由甘肅微藻工程技術(shù)研究中心提供，兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品(成都德思特生物技術(shù)有限公司)。

AE124電子天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)；JPT-10型架盤天平(常熟市衡器廠)；DD-5M立式大容量離心機(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)；XO-SM50超聲波微波組合反應(yīng)系統(tǒng)(南京先歐生物科技有限公司)；JRA-6數(shù)顯磁力攪拌水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取方法

超聲波提取法：準(zhǔn)確稱取鎖陽粉末2 g，按照一定固液比加入體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇，在一定溫度下超聲處理2～10 min，過濾后，得上清液；濾渣按照上述步驟重復(fù)一次，合并上清液。

乙醇/硫酸銨雙水相提取法：準(zhǔn)確稱取鎖陽粉末2 g，按照一定固液比加入30%無水乙醇(w/w)20%硫酸銨(w/w)，在一定溫度下加熱處理20～60 min，過濾，靜置分層后，收集上層提取液。濾渣按照上述步驟重復(fù)一次，合并上清液。

水提法：準(zhǔn)確稱取鎖陽粉末2 g，按照一定固液比加入蒸餾水，在恒溫水浴中提取50～90 min，過濾，收集濾液；濾渣按照上述步驟重復(fù)一次，合并上清液。

微波提取法：準(zhǔn)確稱取鎖陽粉末2 g，按一定料液比加入體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇，微波處理0～12 min，過濾，收集濾液；濾渣按照上述步驟重復(fù)一次，合并上清液。

酶解法：準(zhǔn)確稱取鎖陽粉末2 g，加入一定量果膠酶，在最適pH條件下，在一定溫度下酶解30～70 min，高溫將酶滅活后，過濾，收集濾液；濾渣按照上述步驟重復(fù)一次，合并上清液。

1.2.2 原花青素含量的測定及得率計算

采用香草醛-濃鹽酸法測定原花青素含量[14]；將上述方法制備的原花青素稀釋一定倍數(shù)后各取0.50 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%香草醛3 mL，再加入濃HCl 1.5 mL，避光反應(yīng)30 min后，在500 nm波長處測其吸光值；以0.5 mL蒸餾水代替上清液，重復(fù)上述操作，設(shè)置空白對照。根據(jù)樣液測定的吸光值，計算提取液的濃度。

原花青素得率(%)=

1.2.3 鎖陽原花青素提取工藝優(yōu)化

以單因素試驗為基礎(chǔ)，對超聲波提取法以料液比、超聲功率、提取溫度、提取時間為考察因素，進行L9(34)正交設(shè)計試驗；

乙醇/硫酸銨雙水相萃取法：以料液比、提取溫度、提取時間為考察因素，進行L9(33)正交設(shè)計試驗。

水提法：以料液比、提取溫度、提取時間為考察因素，進行L9(33)正交設(shè)計試驗；

微波法：以料液比、微波功率、提取時間為考察因素，進行L9(33)正交設(shè)計試驗；

酶解法：以料液比、加酶量、提取溫度、提取時間為考察因素，進行L9(34)正交設(shè)計試驗；

1.2.4 原花青素體外抗氧化評價

DPPH·清除能力測定：參考K?ksal等[15]方法略有修改，將上述不同提取方法制備的2 mL原花青素溶液(0.1～0.5 mg/mL)與2 mL濃度為0.15 mmol/L DPPH混勻后，黑暗環(huán)境下靜置30 min，測定其在517 nm處吸光值標(biāo)記為As；將2 mL原花青素溶液分別與2 mL無水乙醇充分混勻后，暗環(huán)境下靜置30 min，將其在517 nm處吸光值標(biāo)記為Ab；將2 mL無水乙醇與2 mL DPPH充分混勻后，暗環(huán)境下靜置30 min，將其在517 nm處吸光值標(biāo)記為A0；采用同濃度Vc代替原花青素溶液作陽性對照，按照以下公式計算清除率。

表2 乙醇/硫酸銨雙水相提取法正交試驗因素水平表Table 2 The factors and levels table of orthogonal test with ethanol-ammonium sulfate two-phase extraction

表3 水提法正交試驗因素水平表Table 3 The factor and levels table of orthogonal test with hot water extraction method

表4 微波法正交試驗因素水平表Table 4 The factors and levels table of orthogonal test with MAE method

表5 酶解法正交試驗因素水平表Table 5 The factors and levels table of orthogonal test with enzymatic extraction method

·OH清除能力測定：將1 mL FeSO4溶液(10 mmol/L)、1 mL水楊酸(6 mmol/L)、1 mL原花青素溶液(0.1～0.5 mg/mL)、1 mL H2O2(20 mmol/L)充分混勻后，37 ℃恒溫水浴30 min，在510 nm波長處測吸光度Ai；將1 mL FeSO4溶液(10 mmol/L)、1 mL水楊酸(6 mmol/L)、1 mL原花青素溶液、1 mL H2O充分混勻后，37 ℃恒溫水浴30 min，在510 nm波長處測吸光度Aj；將1 mL FeSO4溶液(10 mmol/L)、1 mL水楊酸(6 mmol/L)、1 mL H2O、1 mL H2O2(20 mmol/L)充分混勻后，37 ℃恒溫水浴30 min，在510 nm波長處測吸光度A0；采用同濃度Vc代替原花青素溶液作陽性對照，按下述公式計算清除。

1.2.5 原花青素抗糖基化能力評價

1.2.5.1BSA-葡萄糖模擬體系的建立

采用BSA-葡萄糖模擬體系評價蛋白質(zhì)非酶反應(yīng)過程中AGEs形成情況[16]，取濃度為0.15 mol/L的BSA溶液和葡萄糖溶液各1 mL，加入1 mL原花青素溶液(0.1～0.5 mg/mL)充分混勻，在溫度為37 ℃條件下水浴6天后，在λex/λem=370 nm/440 nm測定不同濃度下的熒光值，采用同濃度的氨基胍(AG)代替原花青素作為陽性對照。以不添加原花青素但水浴6天的BSA-葡萄糖模擬體系為對照組；不添加原花青素也不水浴的BSA-葡萄糖模擬體系為空白組。按以下公式計算鎖陽原花青素對BSA-葡萄糖模擬體系A(chǔ)GEs相對抑制率。

式中F樣品為加入鎖陽原花青素提取液且水浴的反應(yīng)液的熒光值；F對照為不添加原花青素但水浴的BSA-葡萄糖模擬體系的熒光值；F空白為不添加原花青素也不水浴的BSA-葡萄糖模擬體系的熒光值。

1.2.5.2 BSA-丙醛酸模擬體系的建立

丙醛酸作為非酶糖基化中間產(chǎn)物，可利用BSA-丙醛酸模擬體系評價蛋白質(zhì)非酶反應(yīng)過程中間產(chǎn)物形成；取濃度為0.15 mol/L的BSA溶液和0.06 mol/L丙醛酸溶液各1 mL，加入1 mL原花青素溶液(0.1～0.5 mg/mL)充分混勻，在溫度為37 ℃條件下水浴6天后，在λex/λem=370 nm/440 nm測定不同濃度下的熒光值；采用同濃度的AG代替原花青素作為陽性對照。以不添加原花青素但水浴6天的BSA-丙醛酸模擬體系為對照組；不添加原花青素也不水浴的BSA-丙醛酸模擬體系為空白組。按1.2.5.1公式計算鎖陽原花青素對BSA-丙醛酸模擬體系A(chǔ)GEs相對抑制率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

正交試驗數(shù)據(jù)分析用SPSS 19.0軟件，制圖采用Origine 9.0軟件。原花青素與抗氧化、抗糖基化相關(guān)性分析采用Pearson法。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取方法對鎖陽原花青素得率的影響

2.1.1 超聲波提取法

根據(jù)單因素試驗確定原花青素提取適宜條件為料液比1∶10(g/mL)、超聲功率90 W、提取溫度50 ℃、提取時間15 min；在此基礎(chǔ)上，進行正交試驗設(shè)計，結(jié)果如表6所示。

由表6極差分析可知，影響鎖陽原花青素得率的4個因素依次為料液比>提取時間>提取溫度>超聲功率。依據(jù)各個因素的K值大小可知，超聲法提取鎖陽原花青素的最佳工藝為A2B3C1D2，即料液比 1∶10(g/mL)、超聲功率100 W、提取溫度30 ℃、提取時間15 min。

表6 超聲法提取鎖陽原花青素正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 6 The orthogonal experimental design and results of Cynomorium songaricum Rupr.procyanidins with UAE method

續(xù)表6 Continued table 6

編號No.ABCD原花青素得率Yield of procyanidins(%)6231212.90731327.53832137.85933216.37K17.728.579.157.34K211.137.838.199.76K37.258.657.739.01R4.430.821.421.70

注：表中K表示每個因素對應(yīng)水平實驗結(jié)果均值；R表示極差,每列最大K值與最小K值得差值，下同。
Note:K represent the average values of experimental results;R refers to the results of extreme analysis,the same as in the following tables.

2.1.2 乙醇/硫酸銨雙水相提取法

由表7極差分析可知，乙醇/硫酸銨雙水相提取法中影響鎖陽原花青素得率3個因素的主次關(guān)系為：料液比>提取溫度>提取時間，根據(jù)K值大小，確定最優(yōu)化工藝為A2B2C3，即料液比1∶10(g/mL)、提取溫度50 ℃、提取時間50 min。

表7乙醇/硫酸銨雙水相提取法提取鎖陽原花青素正交試驗設(shè)計與結(jié)果
Table 7 Orthogonal experimental design and results ofCynomoriumsongaricumRupr.procyanidins with ethanol-ammonium sulfate two-phase extraction method

編號No.ABC原花青素得率Yield of procyanidins(%)111111.12212211.54313311.89421211.62522311.99623110.9573139.0183219.9593328.20K111.5210.5810.67K211.5211.1710.43K39.0510.3311.96R2.430.840.54

2.1.3 水提法

由表8極差分析可知，影響水提法提取鎖陽原花青的主次順序為料液比>提取時間>提取溫度，是影響水提法制備鎖陽原花青素的主次因素，其最佳工藝為A2B2C1，其最佳工藝原花青素得率為9.11%。因此，水提法提取鎖陽原花青素的最佳工藝，即為料液比1∶10(g/mL)、提取溫度40 ℃、提取時間60 min。

2.1.4 微波法

以微波法提取鎖陽原花青素單因素試驗確定條件為基礎(chǔ)，以原花青素得率為評價指標(biāo)，由表9極差分析可知，微波法提取鎖陽原花青素的3個因素，影響大小為：料液比>提取時間>微波功率。各個因素中K值大小可知，其最優(yōu)化工藝為A3B2C3，對該工藝進行驗證，得到微波法提取鎖陽原花青素得率平均值為15.31%。

表8 水提法提取鎖陽原花青素正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 8 Orthogonal experimental design and results of Cynomorium songaricum Rupr.procyanidins with hot water extraction method

表9 微波法提取鎖陽原花青素正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 9 Orthogonal experimental design and results of Cynomorium songaricum Rupr.procyanidins with MAE method

2.1.5 酶法

由極差分析可知，酶法提取中影響鎖陽原花青素提取的4個因素，其主次順序為：料液比>溫度>提取時間>酶量。得出其最優(yōu)工藝為A2B2C2D2，即酶法提取鎖陽原花青素的最佳工藝為：料液比1∶10(g/mL)、加酶量5%、溫度50 ℃、提取時間50 min。鎖陽原花青素平均得率為13.79%(表10)。

表10 酶解法提取鎖陽原花青素正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 10 Orthogonal experimental design and results of Cynomorium songaricum Rupr.procyanidins with enzymatic extraction method

2.1.6 不同提取方法所得原花青素含量的比較

從表11可以看出，與水提法相比，超聲波法、乙醇/硫酸銨雙水相提取法、微波法、酶法均顯著提高鎖陽原花青素得率(P<0.05)，均有效減少了提取時間。其中微波法提取效果最好，其得率最高為(15.31±1.2)%；與水提法相比，其得率提高了122.2%，且提取時間僅為19 min；這是由于水分子能夠吸收微波能量，促使植物細(xì)胞膨脹，有效增加提取溶劑和植物材料的接觸面積；同時，增加植物組織內(nèi)部和溶劑間濃度梯度，傳質(zhì)驅(qū)動力顯著增強，有利于原花青素的提取；超聲波法提取原花青素，使其得率提高88.53%，提取時間僅為水提法的1/4。其原因是利用超聲波的空穴作用、機械作用和熱效應(yīng)，促進植物組織細(xì)胞壁的破碎，使原花青素快速釋放，縮短了時間[17]。乙醇/硫酸銨雙水相提取法使原花青素得率提高74.02%，提取時間為100 min。這是因為該體系采用有機溶劑結(jié)合鹽形成兩相體系，對原花青素進行提取，利用有機溶劑對植物細(xì)胞穿透作用強的特點，在未加其它輔助方法，提取時間相對較長；但此法可有效實現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物和雜質(zhì)的有效分離；酶解法提取，采用較溫和的生物酶法，對細(xì)胞壁進行水解，促使原花青素有效釋放；采用果膠酶對細(xì)胞壁進行了部分裂解，使原花青素緩慢釋放，所以提取時間相對較長。綜上所述，微波法是提取鎖陽原花青素的最優(yōu)方法，且提取時間大大縮短。

表11 不同提取方法所得鎖陽原花青素含量的比較Table 11 Effects of extract methods on the yield of Cynomorium songaricum Rupr.procyanidins

2.2 不同提取方法對原花青素體外抗氧化活性的影響

2.2.1 不同提取方法對原花青素DPPH·清除能力效果的影響

不同方法提取的原花青素對DPPH·清除能力的結(jié)果如圖1所示。不同方法提取的原花青素對DPPH·清除能力隨著原花青素濃度的增加呈逐漸上升趨勢，清除能力大小依次為微波法>酶解法>超聲波法>乙醇硫酸銨雙水相提取法>水提法。但上述五種提取方法所得原花青素對DPPH·自由基的清除能力均低于Vc；曲線回歸方程計算可知，微波法、酶解法、超聲波法、乙醇硫酸銨雙水相提取法、水提法得到的原花青素對DPPH·的半數(shù)清除濃度IC50分別為0.224、0.271、0.314、0.356、0.438 mg/mL。說明原花青素體外抗氧化活性與其提取方法密切相關(guān)，其可能影響原花青素聚合度。

圖1 不同提取方法對原花青素的DPPH·清除能力(A-超聲波法；B-乙醇/硫酸銨雙水相提取法；C-水提法；D-微波法；E-酶解法；F-Vc)Fig.1 DPPH· radicals scavenging activity at different concentrations(A represents UAE,B represents Ethanol-ammonium sulfate two-phase extraction,C represents water extraction,D represents MAE,E represents enzymatic hydrolysis,F represents ascorbic acid)

2.2.2 不同提取方法對原花青素·OH清除能力效果的影響

羥自由基作為活性氧(ROS)之一，在正常機體代謝中處于穩(wěn)定的狀態(tài)；當(dāng)防御體系受到破壞或者產(chǎn)生過量自由基時，氧化應(yīng)激就會發(fā)生；芬頓反應(yīng)可產(chǎn)生羥自由基，其與水楊酸反應(yīng)后，生成在510 nm處有特殊吸收的化合物；天然抗氧化劑可清除ROS或阻止ROS形成。由圖2可知，Vc比鎖陽原花青素具有更強的清除·OH能力；原花青素對·OH清除作用呈現(xiàn)濃度-依賴性；微波法提取的原花青素清除·OH基能力最強，酶法次之，乙醇法和水提法相近，超聲法最弱。曲線回歸方程計算可知，其半數(shù)清除濃度IC50分別為0.236、0.316、0.333、0.356、0.411 mg/mL。此結(jié)果與2.3.1均表明微波法制備的原花青素的抗氧化能力最好，具有適合聚合度，有利于其抗氧化能力的保持。

圖2 不同提取方法所得鎖陽原花青素的·OH清除能力(A-超聲波法；B-乙醇/硫酸銨雙水相提取法；C-水提法；D-微波法；E-酶解法；F-Vc)Fig.2 Scavenging effect of Cynomorium songaricum Rupr.procyanidins on hydroxyl radicals( A represents UAE,B represents Ethanol-ammonium sulfate two-phase extraction,C represents water extraction,D represents MAE,E represents enzymatic hydrolysis,F represents ascorbic acid)

2.3 不同提取方法對原花青素抗糖基化活性的影響

在非酶促條件下，蛋白質(zhì)中游離氨基與還原糖羰基之間會形成AGEs產(chǎn)物，該產(chǎn)物在λex/λem=370 nm/440 nm所測定的熒光值，可反映AGEs形成水平。由圖3A可知，在BSA-葡萄糖模擬體系中，比較了5種提取方法所獲得的原花青素對糖基化抑制效果的影響，微波法、乙醇/硫酸銨雙水相提取法、酶法制備的原花青素具有較高的糖基化抑制率，且高于陽性對照組(AG)；在0.1～0.3 mg/mL范圍內(nèi)，超聲波法提取的原花青素相比陽性對照，具有較高的糖基化抑制率；當(dāng)濃度為0.3～0.5 mg/mL時，超聲波法與陽性對照對糖基化抑制率曲線基本重合；水提法制備的原花青素對糖基化抑制效果最弱，且低于陽性對照。圖3B研究了不同方法制備的原花青素對BSA-丙醛酸模擬體系形成的糖基化產(chǎn)物抑制效果，在原花青素質(zhì)量濃度為0.1～0.5 mg/mL范圍內(nèi)，微波法制備的原花青素具有最高的抑制率，陽性對照AG和乙醇/硫酸銨雙水相提取法制備的原花青素具有相同的抑制效果；與陽性對照相比，酶法、微波法和水提法對糖基化產(chǎn)物抑制效果較??；說明不同方法制備的原花青素均對糖基化產(chǎn)物具有一定程度的抑制效果，可知原花青素的抑制不僅作用于糖基化產(chǎn)物形成的中期，且在糖基化產(chǎn)物形成各個階段均有一定抑制作用。

圖3 不同方法制備原花青素及陽性對照組AG在BSA-葡萄糖(A)和BSA-MGO模擬反應(yīng)體系(B)下的糖基化抑制率(A-超聲波法；B-乙醇/硫酸銨雙水相提取法；C-水提法；D-微波法；E-酶解法；F-AG)Fig.3 Glycation inhibition rates of aminoguanidine (AG) and different extraction methods for extracting proanthocyanidins from Cynomorium songaricum Rupr.in BSA-Glucose model (A) and BSA-MGO model (B)(A represents UAE,B represents Ethanol-ammonium sulfate two-phase extraction,C represents water extraction,D represents MAE,E represents enzymatic hydrolysis,F represents aminoguanidine)

2.4 不同提取方法獲得的原花青素與其抗氧化、抗糖基化線性回歸分析

不同提取方法制備的原花青素均有一定的抗氧化性和抗糖基化，為探究原花青素和抗氧化、抗糖基化之間的關(guān)系，以不同提取方法制備的原花青素含量為自變量，抗氧化性和抗糖基化活性為因變量，進行線性方程擬合，并比較其相關(guān)系數(shù)(表12)。乙醇/硫酸銨雙水相提取法和微波法制備原花青素與其抗氧化線性回歸系數(shù)均呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，而上述二者方法與抗糖基化回歸系數(shù)小，且差異不顯著；水提法與其抗糖基化活性回歸系數(shù)呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)；糖基化反應(yīng)進程可導(dǎo)致自由基的產(chǎn)生，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變、糖鏈分子斷裂及糖基化產(chǎn)物氧化等進程，使氧化應(yīng)激加劇，因此，抗氧化性在一定程度上可反映抗糖基化能力，但抗氧化性能力與抗糖基化活性之間未呈現(xiàn)因果關(guān)系，說明原花青素還具有金屬絡(luò)合、影響蛋白質(zhì)硫醇基團、抑制糖基化中間產(chǎn)物的形成等作用，從而通過上述可能的途徑抑制糖基化終產(chǎn)物的形成，因此，原花青素可能通過其它機理抑制糖基化。

表12 不同方法提取的原花青素與抗氧化、抗糖基化線性回歸系數(shù)Table 12 Linear regression coefficient between proanthocyanidins extracted by different methods and antioxidant and antiglycosylation

注：*表示P<0.05。
Note:*5% significance level.

3 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，微波法對鎖陽原花青素提取效果最佳，該法提取時間較短，操作方便，得率較高；不同提取方法獲得的原花青素均有一定抗氧化和抗糖基化能力，微波法制備的原花青素清除DPPH·和·OH效果最好?？寡趸芰εc抗糖基化無相關(guān)性，微波法和乙醇/硫酸雙水相提取法獲得的原花青素與抗氧化能力呈顯著線性關(guān)系(P<0.05)，而水提法獲得的原花青素與抗糖基化能力呈顯著線性關(guān)系(P<0.05)。因此，鎖陽原花青素可作為抗氧化劑和較好的糖基化反應(yīng)的抑制劑，為天然抗氧劑和抑制劑的開發(fā)提供參考依據(jù)，但不同提取方法對鎖陽原花青素結(jié)構(gòu)的影響及其與抗氧化活性和抗糖基化之間的關(guān)系，有待進一步分析。