金淑秀，王鈺慧，霍乃蕊*，鄭明學，韓克光，古少鵬，田文霞，張 鼎

(1.山西農業(yè)大學 動物科技學院，太谷 030801； 2.山西農業(yè)大學 食品科學與工程學院，太谷 030801)

骨質疏松(osteoporosis，OP)是由于成骨細胞(osteoblast，OB)介導的骨形成與破骨細胞(osteoclast，OC)介導的骨吸收失衡，導致骨吸收大于骨形成而引起的以骨小梁稀疏、斷裂、骨量減少、骨密度下降為特征的骨代謝疾病[1-2]。受集約化養(yǎng)殖、環(huán)境污染、動物生產、其他疾病發(fā)生等因素的影響，畜禽OP越來越受到人們的重視。

除骨形成作用外，OB還參與OC骨吸收活性的調節(jié)[2-4]，在RANK/RANKL/OPG信號通路中，OB分泌的RANKL可識別OC前體細胞表面的RANK并與之結合，轉導骨吸收信號以調節(jié)OC前體細胞的增殖和成熟。另外OB分泌產生的OPG可與RANK競爭性地結合RANKL，從而防止骨的過度吸收，可見OB的數量和活性將直接決定骨量及骨密度[4-6]，提高OB的細胞數量和成骨活性在骨質疏松防治中尤為關鍵。

課題組前期研究表明，羊骨髓肽(marrow peptides，MP)及其鈣螯合物(MP-Ca)對去卵巢大鼠均具有明顯的骨質改善作用，且比雌激素更安全[7]。在抗骨質疏松新藥篩選和藥效學評價中，體外培養(yǎng)的成骨細胞是一種重要模型[2,8]。為進一步揭示MP、MP-Ca改善骨質的機制，本研究通過體外試驗探究二者對成骨細胞增殖及活性影響，并將二者的效果進行比較，為研發(fā)更安全、更有效的OP防治藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

Tensor 27型傅里葉變換紅外光譜儀(Bruker光譜儀器公司)、MC721酶聯免疫檢測儀(上海箐華科技儀器有限公司)、Ⅱ型膠原酶(Sigma)、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(HyClone)、100× 青霉素鏈霉素混合液(北京博奧拓達科技有限公司)、胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)、17β-雌二醇(Sigma)、牛血清白蛋白(BSA Solarbio)、Trition-X100(Sigma)、Cell Counting Kit-8試劑盒(日本同仁)、堿性磷酸酶(ALP)測試盒及總蛋白定量測試盒(南京建成生物工程研究所)、Rat BGP ELISA Kit(上海橋杜生物科技有限公司)。羊骨髓肽(內蒙古錫盟肽好生物制品責任有限公司生產)中的蛋白質含量為96%(以干基計)，DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)中加入10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素混合液制得完全培養(yǎng)基。

1.2 羊骨髓肽鈣螯合物(MP-Ca)的制備及鑒定

以羊骨髓肽(sheep bone marrow peptide，MP)和氯化鈣為原料制備MP-Ca。螯合工藝為[8]：MP濃度89.28 mg·mL-1、肽鈣質量比2∶1、pH8.1、40 ℃螯合30 min、8倍體積乙醇靜置沉淀3 h(乙醇質量分數>95%)，8 000 r·min-1離心10 min，沉淀再經真空冷凍干燥(-26 ℃預凍，工作壓強90～100 Pa，升華溫度45～55 ℃)制得MP-Ca，經測定MP-Ca中的鈣含量為(9.05±0.36)%。用傅里葉紅外光譜儀在4 000～400 cm-1波段內對樣品粉末進行掃描以確定MP-Ca的形成。

1.3 新生大鼠顱骨成骨細胞的分離和純化

無菌條件下，將出生24 h內的SD大鼠[山西醫(yī)科大學動物實驗中心提供SCXK(晉)2015-0001]脫頸處死，采集顱骨，PBS沖洗后剪碎，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液中消化25 min，收集消化液，組織中添加0.1% Ⅱ型膠原酶繼續(xù)消化1 h，收集消化液，合并2次消化液，1 500 r·min-1離心5 min，棄上清，用DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸細胞，移至25 cm2的細胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃，5% CO2)，培養(yǎng)物每隔0.5 h轉至另一培養(yǎng)瓶中，重復2～3次，以除去大部分成纖維細胞而獲得原代成骨細胞，待細胞完全貼壁融合后，以0.25%胰蛋白酶溶液消化，傳代3次獲得純度高、穩(wěn)定性好的成骨細胞[9-10]。

1.4 成骨細胞的鑒定

通過細胞形態(tài)學觀察、茜素紅染色及堿性磷酸酶(ALP)細胞化學染色對“1.3”純化獲得的成骨細胞進行鑒定[11-12]。

1.5 成骨細胞生長曲線的繪制及各受試物最佳作用濃度的確定

將生長良好的第三代成骨細胞以1×104個·孔-1的濃度接種于96孔細胞培養(yǎng)板上，每孔含完全培養(yǎng)基100 μL，37 ℃培養(yǎng)至貼壁后每天換液。用CCK-8法繪制生長曲線時，每天取5孔進行測定，連續(xù)7 d，測定時棄掉舊培養(yǎng)液，每孔加90 μL新鮮培養(yǎng)液和10 μL CCK-8溶液，避光孵育4 h后用酶標儀測定OD450 nm[13]。確定MP、MP-Ca對成骨細胞增殖的影響時，根據生長曲線，將到達平臺期的時間確定為CCK-8法檢測時間。確定各受試物的最佳作用濃度時，每孔的接種濃度均為1×104，培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后，每天換液時在完全培養(yǎng)基中加入不同濃度的受試物進行培養(yǎng)，在之前確定的檢測時間進行檢測，OD450 nm最大值所對應的濃度即為每種受試物的最佳作用濃度。

1.6 MP、MP-Ca對成骨細胞增殖的影響

向96孔板內已經貼壁的成骨細胞中加入100 μL 完全培養(yǎng)基(對照組)或含有最佳作用濃度受試物的完全培養(yǎng)基，繪制各組細胞的生長曲線，方法同“1.5”。

1.7 成骨細胞骨鈣素(BGP)含量及堿性磷酸酶(ALP)活性測定

將成骨細胞以1×104濃度接種到24孔板上，每個處理組6個重復，貼壁后換用添加了最佳作用濃度MP或MP-Ca的完全培養(yǎng)液，每天換液，培養(yǎng)72 h后用0.1%Triton X-100裂解30～40 min，吸取4 μL細胞裂解液測定總蛋白濃度，其他裂解液1 000 r·min-1離心5 min，取30 μL上清液用于BGP含量和ALP活性的測定，按照ALP試劑盒和大鼠BGP ELISA試劑盒的操作步驟進行。ALP的活性通過總蛋白質濃度標準化，表示為King-Armstrong Unit·g-1。

1.8 統(tǒng)計方法

試驗數據采用SPSS 21.0軟件處理，結果以“平均值±標準誤”表示，折線圖、柱狀圖由SigmaPlot 10.0軟件繪制。

2 結 果

2.1 羊骨髓肽鈣螯合物(MP-Ca)的鑒定

如圖1所示，MP和MP-Ca的紅外光譜圖波形一致但未完全重疊，吸收峰發(fā)生了明顯的位移變化。

圖1 羊骨髓肽(MP)與羊骨髓肽鈣螯合物(MP-Ca) 紅外光譜圖Fig.1 The infrared spectrum of short peptide with MP and MP-Ca

對紅外光譜圖進一步分析，結果如表1所示，說明鈣離子主要與骨髓肽游離氨基端的氨基(-NH2)、游離羧基端的羧基(-COOH)以及肽鏈內部的羰基(C=O)發(fā)生了結合，通過螯合，羊骨髓肽變成了羧酸鹽和銨鹽。

表1羊骨髓肽與鈣離子螯合前后紅外光譜分析

Table1Changesofinfraredspectrabeforeandaftercalciumchelatingofbovinebonemarrowoligopeptide

紅外吸收峰Infrared absorption peaksMP波數/cm-1Wave number of MPMP-Ca波數/cm-1Wave number of MP-Ca變化Changes原因分析Reasons官能區(qū)13 289.463 359.19波數增加,譜帶紅移并變N-H伸縮振動即-NH2的Functional area寬,螯合成為銨鹽伸縮振動(νN-H)23 073.49消失COO-對稱振動32 960.742 973.07波數增大,發(fā)生藍移C=O伸縮振動(νC=O)41 651.961 624.58波數減小COO-伸縮振動51 452.35消失COO-對稱振動61 400.791 417.19波數增大COO-對稱振動指紋區(qū)71 162.69消失COO-由伸縮振動變成了變形振動Fingerprint area81 082.43紅移,譜帶變寬9878.96新增加單鍵的伸縮振動,變形振動10663.18消失11555.26570.84紅移,波數增加

2.2 成骨細胞的鑒定

分離的原代成骨細胞經HE染色后，可見細胞呈短梭形、三角形、多邊形、鱗片狀、鋪路石狀等成纖維細胞樣形態(tài)，符合成骨細胞的特征[11-12]，細胞輪廓清晰，細胞質豐富且呈淡紅色，細胞核呈卵圓形，大而清晰(圖2A)。第三代成骨細胞經堿性磷酸酶染色后，視野內可見大量陽性細胞，細胞膜及細胞質內有大量黑褐色顆粒(圖2B)；茜素紅與鈣離子螯合形成可紫紅色或紅色復合物，第三代成骨細胞經茜素紅染色后在細胞表面形成紅染的鈣化結節(jié)(圖2C)。

A.經HE染色的原代成骨細胞；B.經堿性磷酸酶(ALP)染色的第三代成骨細胞；C.經茜素紅染色的第三代成骨細胞鈣化結節(jié)A. HE-stained primary cultured osteoblasts; B. Osteoblasts stained by alkaline phosphatase; C. Calcified nodules on the surface of osteoblasts after Alizarin Red staining圖2 從新生大鼠顱骨細胞中分離培養(yǎng)的成骨細胞(×100)Fig.2 Identificationof osteoblasts isolated from neonatal rat calvarial cell (×100)

2.3 MP、MP-Ca對成骨細胞增殖活性的影響

由生長曲線(圖3A)可知，第三代成骨細胞貼壁后第1天內經過短暫的適應期，第2天便進入指數增殖期，5 d之后進入穩(wěn)定期，此后細胞數目基本穩(wěn)定。因此，確定受試物最佳作用濃度時選擇OB貼壁后的第5天進行檢測。由圖3B、C可知完全培養(yǎng)液中添加不同濃度的受試物，第5天檢測時，MP、MP-Ca均在103μg·mL-1濃度下OD450 nm值最高，細胞數量最多，故確定此濃度為MP、MP-Ca的最適作用濃度。同理，雌激素最適作用濃度為102μg·mL-1。圖3D中的測定結果經方差分析，相同的接種密度，在最適濃度下，雌激素、MP-Ca和MP組的OD450 nm在整個檢測期均高于空白組(P<0.05)，且MP-Ca組的OD450 nm顯著高于MP組(P<0.05)，在第4天時，甚至高于雌激素組(P<0.05)。

A.成骨細胞生長曲線；B、C.不同受試物最適濃度的選擇；D.不同受試物對成骨細胞增殖情況的影響A. The growth curve of cultured osteoblasts; B, C. Selection of optimal concentration for each treatment group; D. Effects of different treatment groups on the proliferation of osteoblasts圖3 各處理組最適濃度的選擇及其對成骨細胞增殖情況的影響Fig.3 Selection of optimal concentration for each treatment group and the effect of them on the growth curve of osteoblasts

以上結果說明MP-Ca和MP表現出雌激素樣作用，均可促進成骨細胞的增殖，且與MP相比，MP-Ca促進作用更顯著(P<0.05)。

2.4 MP、MP-Ca對成骨細胞成骨活性的影響

由圖4可知，MP及MP-Ca處理成骨細胞后，細胞裂解液中的ALP活性及BGP含量盡管極顯著低于雌激素組(P<0.01)，但均極顯著高于空白組(P<0.01)；且MP-Ca處理組的ALP活性及BGP含量均極顯著高于MP處理組(P<0.01)。

3 討 論

受集約化養(yǎng)殖過程中飼養(yǎng)管理方式、日照、飼料配比、激素和抗生素應用、重金屬污染等問題的影響，骨質疏松(osteoporosis，OP)對畜禽健康及動物福利的影響逐漸引起社會關注[6,14-15]。研究表明，OP發(fā)生時，機體的抗氧化水平下降，免疫功能下降，肝、腎、甲狀腺等組織表現出病理變化[16-17]。過去20年來，抗骨吸收藥物一直被作為治療OP的首選，但由于骨吸收與骨形成緊密相關，在抑制骨吸收時，骨形成的減少也不可避免[18-22]，因而促進骨形成的更安全有效的OP防治藥物的研發(fā)日益受到人們的重視。

動物來源的多肽及其鈣螯合物的生物利用度高、安全性好，被證實可促進骨骼生長發(fā)育、提高骨密度、恢復骨質疏松大鼠骨骼微觀結構，具有OP防治作用，同時還具有促進免疫、抗氧化等功能，廣受關注而不斷被開發(fā)[23-26]。但其對骨質的改善作用的相關研究大都集中效果驗證方面，集中在受試物對血液生化指標和骨骼指標的影響方面，對作用機制方面，例如對成骨細胞的增殖和成骨活性的影響報道極少。

大寫字母和小寫字母分別代表0.01水平和0.05水平差異顯著，字母相異表示差異顯著，相同表示差異不顯著Capital letters and lower case letters present significant level α=0.05, and α=0.01. Different letters indicate statistic differences between the treatments, same letters mean no significant differences圖4 各受試物對第三代成骨細胞堿性磷酸酶(ALP)活性及骨鈣素(BGP)含量的影響Fig.4 Effect of tested agents on the activity of alkaline phosphatase and BGP content of third generation osteoblasts

作為生物體的主要組成部分，骨組織內始終進行著由成骨細胞介導的骨形成與由破骨細胞介導的骨吸收組成的骨轉換過程。OB作為調控骨吸收的中心細胞[5]，其增殖分化活動受到抑制是骨質疏松癥的主要原因[7]。成骨細胞的數量與活性將直接決定最終的骨形成量[2]。

在骨代謝過程中會產生多種生化標志物，其中堿性磷酸酶(ALP)是參與骨代謝的重要蛋白質，既可代表成骨細胞的早期分化水平，又代表著骨形成。同樣，骨鈣素(BGP)在成骨細胞分化過程中產生，是骨礦化不可或缺的重要因子[27]。

經紅外光譜鑒定，MP與CaCl2發(fā)生了螯合，形成了羊骨髓肽羧酸鹽和銨鹽[28]，其螯合部位與其他肽鈣螯合物相同[26,29]。MP-Ca和MP均可增強成骨細胞的增殖活性、成骨細胞裂解液中的ALP活性和BGP含量，增強成骨細胞的成骨活性，且同質量濃度MP-Ca的效果優(yōu)于MP，所以MP-Ca中Ca2+的螯合摻入，不僅可降低MP的用量，還可使效果增強，具體作用機制還有待進一步研究。

4 結 論

體外研究表明，效果雖不及雌激素，MP和MP-Ca均可促進OB的增殖并增強其骨形成活性，且MP-Ca效果優(yōu)于MP。