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(河北科技師范學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，河北 昌黎 066600)

北蒼術(shù)(Atractylodeschinensis(DC.)Koidz.)屬于菊科蒼術(shù)屬，為多年生、宿根、草本植物，根狀莖入藥。其性溫，味辛、苦，歸脾、胃、肝經(jīng)；能祛風(fēng)散寒，燥濕健脾，明目；用于腹脹泄瀉、水腫，風(fēng)濕痹痛，風(fēng)寒感冒，雀目夜盲等癥[1]。在我國北方、東北、華北及河南、陜西、寧夏、甘肅、山東等地區(qū)有野生資源分布。北蒼術(shù)是重要中藥材，具有多種藥理活性如抗菌作用、免疫調(diào)節(jié)活性，抗腫瘤及抗骨質(zhì)疏松作用、保肝作用、降血糖作用、抗心律失常作用等。經(jīng)過進(jìn)一步開發(fā)利用在新藥研究開發(fā)方面有著很大的潛力[2-5]。

目前市場上北蒼術(shù)需求主要來自野生資源，人工馴化栽培剛剛起步，人工栽培現(xiàn)狀不容樂觀，栽培的滯后性和野生資源逐漸枯竭致使北蒼術(shù)的價(jià)格居高不下，從而導(dǎo)致供不應(yīng)求[6-7]。利用組織培養(yǎng)技術(shù)可以緩解這種資源短缺的現(xiàn)狀，一來可以在短時(shí)間內(nèi)快速繁殖出大量試管苗，二來可以保存好蒼術(shù)珍貴的種質(zhì)資源[8-9]。

目前，國內(nèi)外的研究主要集中在北蒼術(shù)遺傳學(xué)和藥理學(xué)方面，對(duì)北蒼術(shù)組培的研究較少，缺乏對(duì)北蒼術(shù)組織培養(yǎng)技術(shù)系統(tǒng)性的研究，這為北蒼術(shù)的組織培養(yǎng)研究提供了研究空間和研究價(jià)值[10]。因此，對(duì)北蒼術(shù)組織培養(yǎng)技術(shù)系統(tǒng)性研究具有重要科研價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。因此開發(fā)建立北蒼術(shù)組織培養(yǎng)繁育體系，快速生產(chǎn)大量種苗以滿足人工栽培的需要以及保護(hù)野生北蒼術(shù)資源具有十分重要的意義[8-9,11-13]。

蒼術(shù)是很具有開發(fā)潛力的植物，但國內(nèi)有關(guān)茅蒼術(shù)的組培研究比較多，對(duì)北蒼術(shù)組織培養(yǎng)技術(shù)研究的報(bào)道較少[10]，本試驗(yàn)利用北蒼術(shù)帶芽莖段作外植體，探究影響組培苗再生的因素，為北蒼術(shù)產(chǎn)業(yè)的優(yōu)質(zhì)化、標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)模化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

北蒼術(shù)帶芽幼嫩莖段(本試驗(yàn)材料為秦皇島市同盛醫(yī)藥有限公司提供，由河北科技師范學(xué)院王文頗教授鑒定，于2017年5月采于河北省秦皇島市青龍縣北蒼術(shù)種植基地)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體表面滅菌優(yōu)化試驗(yàn)

取田間生長的2年生北蒼術(shù)春季新萌發(fā)枝條，剪掉葉片，剪成帶1～2個(gè)芽莖段，用洗滌靈涮洗外植體表面，流動(dòng)水沖洗20 min。經(jīng)外植體放置在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行消毒，消毒方法共設(shè)3個(gè)處理(見表1)。培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，內(nèi)含6-BA和NAA，pH值調(diào)至5.8～6.0，培養(yǎng)溫度(23±2) ℃，光照強(qiáng)度1 500～2 200 lx，光暗時(shí)數(shù)分別為12 h。15 d之后調(diào)查外植體的污染率及外植體的芽誘導(dǎo)率。

污染率(%)=(污染的外植個(gè)數(shù)/接種的總外植個(gè)數(shù))×100%；

死亡率(%)=(死亡莖段數(shù)/接種的總外植體數(shù))×100%；

誘導(dǎo)率(%)=(誘導(dǎo)出不定芽外植數(shù)/接種的總外植數(shù))×100%。

表1 外植體表面滅菌試驗(yàn)設(shè)計(jì)

處理編號(hào)滅菌方法175%酒精消毒30s,5%次氯酸鈉消毒20min275%酒精消毒1min,0.1%氯化汞消毒10min375%酒精消毒30s,0.1%氯化汞+吐溫20消毒15min

1.2.2 不定芽增殖培養(yǎng)

在MS里添加不同濃度6-BA(1，1.5，2，2.5，3 mg/L)與NAA 0.25 mg/L配比組合，共5個(gè)處理，對(duì)照處理不添加激素。滅菌前pH值調(diào)至5.8～6.0。誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后統(tǒng)計(jì)外植體不定芽誘導(dǎo)率，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。誘導(dǎo)率見1.2.1。

增殖系數(shù)(%)=(總不定芽數(shù)/接種的總外植數(shù))×100%。

1.2.3 北蒼術(shù)莖段不定芽伸長培養(yǎng)

在MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的IBA、NAA、GA3等植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)(見表3)。8周后觀察不定芽伸長狀況，調(diào)查各處理的不定芽伸長狀況，對(duì)比不同植物激素對(duì)組培苗莖伸長的影響。

伸長率(%)=(伸長外植體外植數(shù)/接種的總外植數(shù))×100%；

伸長高度(%)=(外植體伸長高度之和/外植個(gè)數(shù))×100%。

1.2.4 北蒼術(shù)組培苗生根培養(yǎng)

將不定芽剪成單株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中。試驗(yàn)設(shè)計(jì)以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA(0，0.2，0.5，0.8 mg/L)，完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，共計(jì)4個(gè)處理。培養(yǎng)3周后調(diào)查不定芽生長狀況。

生根率(%)=(生根的組培苗數(shù)/接種的總組培苗數(shù))×100%。

1.2.5 北蒼術(shù)組培苗煉苗移栽

當(dāng)北蒼術(shù)組培苗4～6條根，根長3～5 cm時(shí)，進(jìn)行煉苗，3 d后取出組培苗，洗凈附著在根上的培養(yǎng)基，準(zhǔn)備移栽。移栽基質(zhì)為蛭石∶草炭土比例為1∶1，草炭土、蛭石在使用前高溫滅菌。移栽后組培苗用塑料薄膜覆蓋保濕，每天觀察、噴水、適時(shí)揭膜通風(fēng)，待長出新葉后去掉地膜。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌方法對(duì)北蒼術(shù)帶芽莖段的影響

較高濃度次氯酸鈉堿性太強(qiáng)，在進(jìn)行外植體表面消毒對(duì)外植體的傷害較大，死亡率最高(達(dá)55.00%)，外植體呈黑褐色，嚴(yán)重影響不定芽的再生，芽誘導(dǎo)率僅為21.67%；低濃度氯化汞對(duì)于外植體的傷害較小，處理2污染率最高(為48.33%)，但死亡率最低(為23.33%)，在處理3中，氯化汞的消毒時(shí)間延長且加入表面活性劑吐溫后，污染率最低(為16.67%)，同時(shí)芽誘導(dǎo)率最高(為53.33%)。最佳表面消毒方法為75%酒精消毒30 s，0.1%氯化汞+吐溫20消毒15 min。

圖1 不同滅菌處理的效果比較

2.2 不同濃度6-BA與NAA配比對(duì)不定芽增殖的影響

6-BA與NAA不同濃度配比組合均促進(jìn)了不定芽的增殖及生長。外植體在不定芽增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周后基部有愈傷組織形成，3周后開始出現(xiàn)不定芽。6-BA與NAA配比對(duì)不定芽的形成有影響，當(dāng)NAA濃度為0.25 mg/L時(shí)，隨著6-BA濃度的升高(1～3 mg/L)，不定芽誘導(dǎo)率、增殖系數(shù)都表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，在2.0 mg/L時(shí)(處理3)達(dá)到最高，隨后下降。6-BA濃度對(duì)不定芽的質(zhì)量也有影響，當(dāng) 6-BA濃度過高，達(dá)到3 mg/L時(shí)不定芽的葉片卷曲，出現(xiàn)玻璃化苗和畸形苗現(xiàn)象。在未添加任何激素的MS培養(yǎng)基中，未能誘導(dǎo)不定芽增殖。綜合不定芽的誘導(dǎo)數(shù)量及質(zhì)量，本試驗(yàn)范圍內(nèi)以6-BA 2 mg/L與NAA 0.25 mg/L配合適宜北蒼術(shù)莖段不定芽增殖。

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)北蒼術(shù)莖段不定芽伸長的影響

在北蒼術(shù)伸長試驗(yàn)中，添加GA3并輔以NAA和IBA(見表3)。試驗(yàn)結(jié)果表明，6個(gè)處理均能不同程度誘導(dǎo)北蒼術(shù)不定芽伸長，并且隨著GA3濃度的增加不定芽也隨之增高，在0.8 mg/L時(shí)伸長高度及伸長率均顯著高于其他處理。當(dāng)培養(yǎng)基中同時(shí)添加GA3與NAA和IBA時(shí)顯著提高了不定芽伸長率及伸長高度，以處理3效果最佳，不定芽伸長率達(dá)到92.86%。

注：a為添加NAA后基部出現(xiàn)愈傷組織，b為不添加NAA的處理。圖4 組培苗生根狀況

表明添加NAA和IBA有助于促進(jìn)GA3誘導(dǎo)伸長。綜上所述，在GA30.8 mg/L+NAA 0.1 mg/L+IBA0.1 mg/L處理中，芽伸長效果最好。

表2 不同激素組合對(duì)不定芽增殖誘導(dǎo)的影響

處理編號(hào)6-BA(mg/L) NAA(mg/L)不定芽誘導(dǎo)率(%)不定芽增殖系數(shù)11.00.2593.33a1.65ab21.50.2597.22a2.04ab32.00.2594.44a2.21a42.50.2580.13a1.27b53.00.2580.71a1.17bck0.00.00.00b0.00c

注：不同小寫字母表示差異顯著(α=0.05)。下同。

圖2 不定芽誘導(dǎo)及增殖情況

2.4不同濃度NAA對(duì)北蒼術(shù)組培苗生根的影響

逐漸增加NAA濃度，生根率呈現(xiàn)為逐漸降低的趨勢(shì)。不添加NAA的MS培養(yǎng)基生根率較高，最高達(dá)到93.61%，且基部未形成愈傷組織(圖4)。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，添加NAA后不定芽基部有愈傷組織出現(xiàn)(圖4)。在生根階段，愈傷組織的形成影響營養(yǎng)物質(zhì)的輸導(dǎo)，不利于不定芽生根后續(xù)的移栽。因此，不添加NAA的MS培養(yǎng)基即可作北蒼術(shù)莖段組培苗生根培養(yǎng)。

3 討論與結(jié)論

3.1 討 論

3.1.1 滅菌方法

外植體消毒是組培成功與否的關(guān)鍵因素之一。北蒼術(shù)體表多毛，采自自然環(huán)境中的枝條帶菌較多不易消除，容易造成污染。消毒劑使用濃度和時(shí)間是重要參數(shù)，直接影響組培的污染率和對(duì)外植體的傷害程度。次氯酸鈉對(duì)環(huán)境、人畜的毒性極小。氯化汞則對(duì)環(huán)境和人畜毒性較強(qiáng)但氯化汞的消毒效果較為有效，是常用的外植體消毒劑。袁媛等[12]采用0.1%氯化汞浸泡10 min對(duì)蒼術(shù)種子進(jìn)行消毒；巢建國等[11]采用75%酒精消毒30 s加0.1氯化汞浸泡15 min對(duì)茅蒼術(shù)種子進(jìn)行消毒，種子有種皮進(jìn)行保護(hù)，消毒劑對(duì)種子的傷害較小。朱玉球等[14]采用75%酒精消10 s加0.1%氯化汞消毒10 min對(duì)白術(shù)根莖進(jìn)行消毒，效果較好。本研究結(jié)果表明，采用75%酒精消毒30 s之后用0.1%氯化汞加吐溫20消毒15 min滅菌效果最好，污染率低、外植體死亡率低、不定芽誘導(dǎo)率高；添加吐溫后增加了氯化汞對(duì)外植體的浸潤及附著，提高滅菌效果。本試驗(yàn)研究顯示高濃度次氯酸鈉的強(qiáng)堿性對(duì)北蒼術(shù)帶芽莖段影響較大，但后續(xù)試驗(yàn)中會(huì)繼續(xù)探索更加適宜北蒼術(shù)的消毒濃度及消毒時(shí)間。

圖3 不同濃度NAA對(duì)北蒼術(shù)組培苗生根的影響

表3 不同種類激素組合對(duì)北蒼術(shù)不定芽伸長的影響

處理編號(hào)GA3(mg/L)NAA(mg/L )IBA(mg/L)伸長高度(mm)伸長率(%)10.20.10.15.94b59.82bc20.50.10.15.58bc81.25ab30.80.10.18.62a92.86a40.2004.08c31.25c50.5004.94bc37.50c60.8005.71b58.93bcck0000.00d0.00d

3.1.2 叢生芽增殖培養(yǎng)

細(xì)胞分裂素是不定芽誘導(dǎo)的主要因素[15-16]，其中多采用6-BA進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。在一定范圍內(nèi)北蒼術(shù)不定芽的誘導(dǎo)率隨著細(xì)胞分裂素濃度的增高而提高，但濃度過高的細(xì)胞分裂素不利于苗生長，易出現(xiàn)玻璃化、畸形、苗弱等現(xiàn)象。薛翔楠[17]研究的適宜茅蒼術(shù)莖段組培苗增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.5 mg/L，黃波[18]在茅蒼術(shù)增殖培養(yǎng)基中添加6-BA 2 mg/L、NAA 0.6 mg/L增殖效果最好；左靜靜等[19]認(rèn)為1/2 MS+6-BA 2 mg/L+KT 1 mg/L+NAA0.5 mg/L是最適北蒼術(shù)組培苗增殖培養(yǎng)基。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不定芽增殖階段的培養(yǎng)基中6-BA濃度2 mg/L、NAA濃度為0.25 mg/L時(shí)效果最好，并且組培苗生長狀況良好。

3.1.3 不定芽伸長培養(yǎng)

一年生北蒼術(shù)種子實(shí)生苗葉基生，沒有地上莖，越冬后的第2年生苗才會(huì)長出地上莖。在組培中再生的不定芽葉叢生，莖亦不伸長，影響成苗率。本試驗(yàn)在培養(yǎng)基中單獨(dú)添加GA3可以誘導(dǎo)北蒼術(shù)組培苗地上莖伸長，同時(shí)加入IBA和NAA的效果顯著好于單獨(dú)添加GA3，這與洋桔梗伸長的研究結(jié)果[20-22]相似，說明GA3和IBA、NAA有協(xié)同作用。

3.1.4 不定芽生根培養(yǎng)

組培苗生根培養(yǎng)在整個(gè)組織培養(yǎng)過程中是關(guān)鍵的一個(gè)步驟，如果沒有根系則無法進(jìn)行移栽后應(yīng)用。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在添加生長素NAA后，組培苗基部有愈傷組織出現(xiàn)，不添加生長素的MS培養(yǎng)基適合北蒼術(shù)組培苗生根的培養(yǎng)基配方。任建偉等[23]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)添加較高濃度生長素時(shí)，組培苗基部有愈傷組織出現(xiàn)，與本研究相似。植物組織培養(yǎng)中在生根階段如果發(fā)生愈傷組織的形成會(huì)影響營養(yǎng)物質(zhì)的輸導(dǎo)，不利于組培苗后續(xù)的移栽成活。李文等[13]在以南蒼術(shù)組培苗生根培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間為30 d統(tǒng)計(jì)，最適宜的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.5 mg/L。左靜靜等[19]在研究北蒼術(shù)組培苗生根培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間為45 d，認(rèn)為1/2 MS+NAA 0.5 mg/L為最適宜北蒼術(shù)組培苗生根的培養(yǎng)基，與本試驗(yàn)結(jié)果不同。原因可能是由于調(diào)查時(shí)間不同造成本試驗(yàn)的結(jié)果與其他學(xué)者的結(jié)果有差異。

3.2 結(jié) 論

本試驗(yàn)以北蒼術(shù)帶芽莖段作為外植體進(jìn)行離體快繁，成功誘導(dǎo)出不定芽并且移栽成活。將帶芽莖段采用75%酒精消毒30 s后，再用0.1%氯化汞、吐溫20消毒15 min對(duì)外植體進(jìn)行表面消毒，此方法消毒后的芽誘導(dǎo)率較高，且污染率低。最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.25 mg/L，由此獲得的不定芽增殖系數(shù)最高，長勢(shì)最好；最適宜組培苗伸長的培養(yǎng)基為MS+GA30.8 mg/L+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L，組培苗生長健壯。北蒼術(shù)組培苗生根較容易在不添加NAA的MS培養(yǎng)基即可生根培養(yǎng)，且根的生長狀態(tài)較好。移栽基質(zhì)蛭石∶草炭土比例為1∶1時(shí)，移栽成活率在90%以上。