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(1.河北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/河北省作物生長調(diào)控實驗室，河北 保定 071001；2.河北省淶源縣崟茂豬苓種植場，河北 淶源 074300)

豬苓[Polyporusumbellatus(Pers.)Fr.]為藥用真菌，又叫豕苓、豬茯苓、野豬屎、地烏桃，分類學上屬于無隔擔子菌亞綱(Holoba-sidiomycetidae)、無褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、多孔菌屬(Polyporus)[1]。其性平，味甘淡，具利水滲濕的功效，用于水腫，淋濁，泄瀉，帶下和小便不利[2]。隨著以豬苓為原料的成品藥如豬苓多糖注射液、豬苓湯、豬苓散等不斷開發(fā)，野生豬苓已不能滿足原料藥材需求，人工栽培豬苓一定程度上緩解了豬苓藥材的供需緊張狀況。目前人工栽培豬苓主要是無性繁殖(即用豬苓苓種做繁殖材料，與蜜環(huán)菌伴栽，苓種得到蜜環(huán)菌提供的養(yǎng)分后菌絲迅速繁殖，突破菌核表皮層，長出白色幼小的苓頭并不斷增大，形成新的豬苓)，如果苓種質(zhì)量不合格，或者使用退化苓種均可能導(dǎo)致接菌率低或空窩。因此，開展豬苓苓種質(zhì)量的調(diào)查研究，制定相應(yīng)的苓種分級指標，可有效規(guī)范豬苓苓種市場，為豬苓人工栽培提供有力保證。

表1 豬苓苓種樣品來源

批次苓種產(chǎn)地及生長方式批次苓種產(chǎn)地及生長方式1淶源縣崟茂豬苓種植場 仿野生3年7淶源縣留家莊鄉(xiāng)坡水村 野生多年2淶源縣崟茂豬苓種植場 仿野生4年8淶源縣留家莊鄉(xiāng)小道村 野生多年3淶源縣崟茂豬苓種植場 仿野生5年9淶源縣留家莊鄉(xiāng)團圓村 野生多年4赤城縣樣田鄉(xiāng)雙山寨村 仿野生2年10淶源縣留家莊鄉(xiāng)石片村 野生多年5赤城縣樣田鄉(xiāng)雙山寨村 仿野生3年11淶源縣上莊鄉(xiāng)橫山嶺村 野生多年6淶源縣留家莊鄉(xiāng)伊家鋪村 野生多年12淶源縣東團堡鄉(xiāng)箭桿河村 野生多年

關(guān)于豬苓苓種的質(zhì)量，多憑形態(tài)評判質(zhì)量優(yōu)劣和人工挑選苓種。張世榮認為，苓種應(yīng)選擇表面凹凸不平，多疤狀，色澤鮮艷，手捏有彈性，鮮嫩不干漿，生活力強，出芽快而多的灰苓或者黑苓做種；白苓易腐爛，不能做種[3]。王天媛等認為，年幼生命力強，斷面菌絲白色，含水率大，萌發(fā)新點多的灰苓適合作苓種[4]。陳文強等認為，具彈性、斷面菌絲為白色或微黃色、新鮮無霉變的黑苓也可作苓種[5]。綜上，生產(chǎn)中豬苓苓種質(zhì)量良莠不齊，目前尚無苓種質(zhì)量的檢驗規(guī)程，缺乏具體的質(zhì)量評價指標。本試驗廣泛收集河北省淶源、赤城等不同批次的豬苓苓種樣品，參考淮山藥[8]、懷地黃[7]、姜黃[8]、知母[9-10]等種苗質(zhì)量分級研究方法，測定分析豬苓苓種的單苓鮮重、密度、色澤、硬度、苓種活力、含水率等指標，初步確定豬苓苓種的質(zhì)量分級指標，為豬苓苓種的質(zhì)量評價和生產(chǎn)提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試豬苓苓種樣品來源于不同產(chǎn)地和不同生長年限的12批次豬苓苓種(詳見表 1)，經(jīng)河北農(nóng)業(yè)大學楊太新教授鑒定為多孔菌科豬苓。

1.2 試驗儀器

LX-C型邵氏硬度計，CR-400色差計，DHG-9240 A電熱恒溫鼓風干燥箱，BS-223 S電子分析天平，HCP-100手提式高速中藥粉碎機，BIC-250型智能光照培養(yǎng)箱，MLS-3750型高壓蒸汽滅菌器，HS-1300-U潔凈工作臺，游標卡尺，干燥器，刀片，鑷子，吸水紙，無菌棉，鋁盒，培養(yǎng)皿，溢流杯，量筒等。

1.3 試驗方法

采用隨機取樣法，每批次樣品選取具有代表性苓種30個，逐個測定其單苓鮮重、密度[11]、色澤[12-13]、硬度[14]、苓種活力和含水率等指標。

單苓鮮重：將苓種表面清洗干凈，用吸水紙吸干表面水分，然后用千分之一電子天平進行稱量。

密度：借助阿基米德原理(浮力法)測量，將苓種浸入盛滿水的溢流杯中，溢出的水用量筒接取，讀數(shù)為苓種體積；苓種密度為單苓鮮重與對應(yīng)苓種體積的比值。

色澤：使用色差計進行測定，以白陶瓷板為標準值校準后，對苓種斷面(將苓種切出直徑約2 cm的斷面)進行色澤測定，結(jié)果包括L*、a*、b*值。L*代表苓種斷面亮度，L*的取值范圍為0～100，L*越小越接近黑色，L*越大則越接近白色；a*代表苓種斷面紅綠度，a*=0時為灰色，+a*表示紅色，-a*表示綠色；b*代表苓種斷面黃藍度，b*=0時為灰色，+b*表示黃色，-b*表示藍色。

硬度：將硬度計垂直于切出的斷面，在均勻力的作用下將壓頭壓入，以此時指針的讀數(shù)作為苓種的硬度值，重復(fù)6次，取平均值作為該苓種的硬度值。

苓種活力的測定：將豬苓苓種清洗干凈，放入0.2%的金霉素溶液中浸一下，立即取出，用無菌棉擦干凈，然后按無菌操作要求，用刀片從豬苓苓種中間切開，用無菌鑷子在菌核中央挑取一塊0.3 cm大小的菌肉[15]，迅速將其放于制備好的PDA培養(yǎng)基上，置于(23±2)℃[16]條件下培養(yǎng)。分別在第15天和第30天測量菌落直徑，以菌絲體日均生長速度(15 d內(nèi)菌落直徑的生長量除以15)為評價活力的指標。

含水率的測定：將挑取菌絲后的苓種用粉碎機粉碎，置于已知重量的小鋁盒內(nèi)，半蓋盒蓋，用電子天平稱重記錄后，置于(103±2)℃的恒溫烘箱內(nèi)。7 h后取出，蓋好蓋子，放入裝有硅膠的干燥器中，打開蓋子，冷卻至室溫，蓋好盒蓋，取出稱重，進行含水率計算。

苓種含水率(%)=[(W2-W3)/(W3-W1)]×100%(式中：W1為小鋁盒重量；W2為小鋁盒和新鮮豬苓樣品的總重量；W3為小鋁盒和干樣品的總重量)。

1.4 數(shù)據(jù)分析與等級劃分

試驗結(jié)果采用SPSS 22.0軟件進行參數(shù)統(tǒng)計分析描述和主成分分析，確定豬苓苓種質(zhì)量分級指標。

對苓種活力和苓種斷面亮度L*2個指標進行K-聚類并得到聚類結(jié)果，對苓種斷面黃藍度b*指標采用種苗參數(shù)標準差法[17](以平均值加1倍的標準差作為三等苓種的上限點，平均值作為二、三級的分界點，以平均值減1倍的標準差作為一、二級苓種的分界點)得到b*的等級劃分結(jié)果。最后綜合K-中心聚類的聚類結(jié)果和種苗參數(shù)標準差法的等級劃分結(jié)果并結(jié)合生產(chǎn)實際，制定出豬苓苓種質(zhì)量指標的最終分級結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬苓苓種分級指標的確定

2.1.1 豬苓苓種質(zhì)量指標的測定結(jié)果

12批次豬苓苓種的單苓鮮重、密度、硬度、含水率、色澤和苓種活力等指標測定結(jié)果如表2所示。豬苓苓種的質(zhì)量指標以苓種斷面紅綠度a*變化最大，變異系數(shù)為0.545，變化范圍為0.45～9.62；其次是單苓鮮重，變異系數(shù)為0.446，變化范圍為9.032～40.119 g；再次是苓種活力，變異系數(shù)為0.414，變化范圍為0.03～0.631 mm/d；密度、硬度、含水率和苓種斷面黃藍度b* 4個指標的變異系數(shù)均較小，在0.217～0.271之間；苓種斷面亮度L*的變異系數(shù)最低，為0.102。

表2 豬苓苓種質(zhì)量指標的統(tǒng)計描述

指標極小值極大值均值標準差變異系數(shù)單苓鮮重(g)9.03240.11917.3207.7290.446密度(g/mL)0.1731.2490.6830.1660.243硬度8.6071.8044.5712.100.271含水率(%)19.6879.0740.1010.760.268苓種斷面亮度L*43.8480.7169.617.120.102色澤苓種斷面紅綠度a*0.459.624.102.240.545苓種斷面黃藍度b*1.1430.0420.344.400.217苓種活力(mm/d)0.0300.6310.3300.1370.414

2.1.2 豬苓苓種質(zhì)量指標的主成分分析

考察特征值λ>1，并綜合考慮方差貢獻率確定最優(yōu)的主成分數(shù)。由主成分分析結(jié)果(表3)可見，前3個特征值的累計貢獻率已達68.357%，故取前3個為主成分。說明前3個主成分基本包含了豬苓苓種的大部分指標信息。

取前3個特征值，由主成分的載荷矩陣計算主成分特征向量和特征根(表 4)，得到以下3個主成分表達式：

F1=0.051×單苓鮮重+0.256×密度+0.048×硬度+0.285×含水率-0.481×L*+0.376×a*+0.541×b*-0.544×苓種活力；

F2=-0.193×單苓鮮重+0.638×密度-0.709×硬度-0.024×含水率-0.036×L*-0.151×a*-0.132×b*+0.107×苓種活力；

F3=0.851×單苓鮮重+0.023×密度+0.200×硬度+0.229×含水率+0.223×L*+0.041×a*+0.221×b*+0.285×苓種活力。

表3 主成分變量解釋

主成分方差貢獻貢獻率(%)累積貢獻率(%)12.98337.28437.28421.44218.02655.3131.04413.04768.35740.9111.37179.72850.7919.89189.61960.3924.90294.52170.3734.65799.17880.0660.822100

表4 主成分特征向量和特征根

項目特征向量特征根主成分123123單苓鮮重0.088-0.2320.870.051-0.1930.851密度0.4420.7660.0230.2560.6380.023硬度0.0830.8510.2040.0480.7090.200含水率0.4920.0290.2340.2850.0240.229L*-0.8300.0430.228-0.4810.0360.223a*0.650-0.1810.0420.376-0.1510.041b*0.934-0.1580.2260.541-0.1320.221苓種活力-0.940.1280.291-0.5440.1070.285

綜上，第1個主成分的方差貢獻率最高，又因在第1個主成分表達式中，苓種活力、苓種斷面黃藍度b*和苓種斷面亮度L*的系數(shù)均較其他幾個指標的系數(shù)大，因此可以把苓種活力、苓種斷面黃藍度b*和苓種斷面亮度L*確定為苓種質(zhì)量分級的指標。

2.2 豬苓苓種質(zhì)量指標等級初步劃分

采用SPSS 22.0軟件進行K-聚類分析，將苓種質(zhì)量指標中苓種活力和苓種斷面亮度L*2個指標聚為3類(表 5)。

表5 豬苓苓種活力和斷面亮度L*的最終聚類結(jié)果

指標類別1類別2類別3苓種活力(mm/d)0.1640.2480.399苓種斷面亮度L*53.9565.3374.34

采用1.4中種苗參數(shù)標準差法對苓種質(zhì)量指標苓種斷面黃藍度b*進行劃分，結(jié)果見表 6。

表6 豬苓苓種斷面黃藍度b*的劃分結(jié)果

級別ⅠⅡⅢ苓種斷面黃藍度b*15.9420.3424.74

2.3 苓種質(zhì)量指標的分級結(jié)果

根據(jù)豬苓苓種活力和斷面亮度L*的最終聚類結(jié)果和斷面黃藍度b*的劃分結(jié)果，并結(jié)合豬苓生產(chǎn)中的苓種大小，得到各等級分級結(jié)果，見表7。

表7 豬苓苓種質(zhì)量分級指標

指標ⅠⅡⅢ苓種活力(mm/d)≥0.399≥0.248≥0.164苓種斷面亮度L*≥74≥65≥54苓種斷面黃藍度b*≤16≤20≤25單苓鮮重(g)≥10.0≥10.0≥10.0

3 結(jié)論與討論

目前，中藥材種子種苗質(zhì)量分級的研究多見報道[18-22]。豬苓屬于真菌類中藥材，豬苓苓種質(zhì)量成為人工栽培豬苓的制約因素，前人研究多憑形態(tài)判斷苓種質(zhì)量優(yōu)劣和人工挑選苓種[3-5]，尚未見苓種質(zhì)量分級的相關(guān)研究。本研究收集不同產(chǎn)地和不同生長年限的12批次豬苓苓種樣品，對苓種質(zhì)量的各指標進行了測定分析，并采用k均值聚類法和標準差法相結(jié)合將豬苓苓種初步分為3個等級。一級苓種：苓種活力≥0.399 mm/d，苓種斷面亮度L*≥74，苓種斷面黃藍度b*≤16；二級苓種：苓種活力≥0.248 mm/d，苓種斷面亮度L*≥65，苓種斷面黃藍度b*≤20；三級苓種：苓種活力≥0.164 mm/d，苓種斷面亮度L*≥54，苓種斷面黃藍度b*≤25。且各等級苓種均應(yīng)：單苓鮮重≥10.0 g。建議豬苓人工栽培時選用一、二級苓種，利于提高苓種接菌率和豬苓產(chǎn)量，該分級結(jié)果為豬苓苓種的質(zhì)量評價和指導(dǎo)豬苓苓種生產(chǎn)提供參考。

本研究通過對豬苓苓種的苓種活力、斷面色澤、密度、硬度、含水率、單苓鮮重等指標研究，初步確定了分級的4項指標。苓種活力在一定程度上直接反映了苓種內(nèi)部菌絲的生活力，這與王天媛等[4]的研究結(jié)果一致。苓種斷面亮度L*可反映苓種菌絲白色程度，苓種斷面黃藍度b*可反映苓種菌絲的黃色程度，均能夠反映苓種生活力高低，這與陳文強等[5]的研究結(jié)果一致。單苓鮮重反映苓種的大小，也與苓種含水率密切相關(guān)，生產(chǎn)中可進行人工控制，單苓重較大時人工栽培的用種量大，生產(chǎn)成本高，較小則影響苓種的接菌率和豬苓產(chǎn)量，因此也將其作為分級指標之一。關(guān)于豬苓苓種質(zhì)量的其他指標及其與質(zhì)量的相關(guān)關(guān)系有待進一步探討。