，，， ，

( 1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025； 2.國(guó)家小麥改良中心貴州分中心，貴州 貴陽(yáng) 550025)

小麥在糧食作物中有著舉足輕重的地位，無論是栽培面積還是經(jīng)濟(jì)效益都不亞于水稻和玉米。中國(guó)是最早種植小麥的國(guó)家之一。普通小麥(Triticumaestivum，2 n=42)是異源六倍體，屬于禾本科(Triticeas)小麥族(Triticeas)小麥屬(Triticum)。研究認(rèn)為，普通六倍體小麥的進(jìn)化至少歷經(jīng)了兩次遠(yuǎn)緣雜交與一次異源多倍體化，A基因組供體烏拉爾圖小麥(T.Urartu，2 n=14)與B基因組供體擬斯卑爾托山羊草(Ae.Speltodies，2 n=14)雜交形成二粒小麥(T.turgidum，2 n=28)，歷經(jīng)多年進(jìn)化，又與D基因組供體粗山羊草(Ae.Tauschii，2 n=14)雜交，形成六倍體小麥并最終演變成普通小麥(AABBDD)[1-3]。多年來，在小麥的進(jìn)化過程中，隨著不斷的雜交，自然及人工選擇，發(fā)生大量有利性狀的控制基因丟失，或受環(huán)境條件的影響使得原有的基因失效(如質(zhì)量、產(chǎn)量、抗病性、抗逆性等)，造成了普通小麥在這些方面的缺陷[4]。迫于如此情形下，選育產(chǎn)量高、品質(zhì)好、株型合適及抗性良好的新品種在小麥育種工作中已經(jīng)顯得刻不容緩。近些年，采用遠(yuǎn)緣雜交、細(xì)胞工程育種、分子標(biāo)記、基因克隆以及染色體工程等方法將不同種屬中含有的有利基因?qū)胫疗胀ㄐ←溁蚪M中，已成功育成諸多具備高產(chǎn)潛力、抗病、抗逆性優(yōu)良等的小麥新品種[5]。

細(xì)胞學(xué)鑒定發(fā)展至如今，無論是分帶鑒定技術(shù)還是核型分析方法，都能夠快速、有效且準(zhǔn)確的對(duì)不同物種染色體的數(shù)目、組成與結(jié)構(gòu)進(jìn)行判斷分析。采用熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence In Situ Hybridization，F(xiàn)ISH)，待測(cè)染色體中的DNA與具熒光標(biāo)記的探針(特異寡聚核苷酸片段)結(jié)合，從而檢測(cè)DNA序列在染色體上的位置。近年來，DNA重復(fù)序列被廣泛用于未知染色體鑒別、物種起源與進(jìn)化及指紋圖譜構(gòu)建等，還能對(duì)遺傳物質(zhì)來源進(jìn)行追溯鑒定。Pedersen等[6]利用來自節(jié)節(jié)麥的pAs 1探針及來自大麥且含有(GAA)8重復(fù)序列的pHvG 38探針有效鑒別了中國(guó)春3個(gè)基因組染色體。Cuadrado A等[7]利用5個(gè)高度重復(fù)序列pTa 71、pTa 794、pSc 34、pSc 74和pSc 119.2 探針對(duì)黑麥進(jìn)行多次FISH分析，成功鑒別了A、B及R基因組染色體。Mukai等[8]利用pSc 119.2 及pAs 1 兩個(gè)重復(fù)序列探針，不僅有效鑒別并建立中國(guó)春的B、D基因組清晰的FISH核型，還成功識(shí)別其A基因組的1 A、4 A、5 A染色體。Tang等[9]利用重復(fù)序列pAs 1、pTa-535以及pSc 119.2為熒光標(biāo)記探針，建立了普通小麥中國(guó)春3種基因組染色體FISH核型。本研究擬采用pAs 1與pSc 119.2-1 2種不同顏色的重復(fù)序列探針開展貴紫麥1號(hào)熒光原位雜交分析，構(gòu)建其FISH核型，明確各染色體對(duì)的信號(hào)分布特點(diǎn)，為該品種在小麥育種工程中的運(yùn)用及后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為貴紫麥1號(hào)，由3個(gè)不同種屬材料節(jié)節(jié)麥/偏凸山羊草/硬粒小麥歷經(jīng)多年多代雜交而來，是貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院國(guó)家小麥改良中心貴州分中心自主創(chuàng)制的一個(gè)特色紫粒小麥品種(審定編號(hào)：黔審麥2015003號(hào))。貴紫麥1號(hào)抗性優(yōu)良(抗病、抗逆、耐貧瘠等)、產(chǎn)量高、品質(zhì)好，其紫色籽粒含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，種皮還富含能預(yù)防人類癌癥及心腦血管病的花青苷黃酮類化合物。

1.2 染色體制片

選取10～20粒飽滿種子，常溫下用雙蒸水浸泡4～6 h，用鑷子取種子均勻擺放在鋪有干凈濕潤(rùn)濾紙的塑料培養(yǎng)皿上25 ℃進(jìn)行發(fā)芽，每天用雙蒸水進(jìn)行3～5次沖洗，根長(zhǎng)2～3 cm時(shí)，取根尖進(jìn)行2 h笑氣(N2O)處理，90%冰乙酸冰上固定5 min，蒸餾水沖洗3遍，切取根尖分生區(qū)進(jìn)行37 ℃纖維素酶果膠酶混合液酶解50 min，進(jìn)行滴片。在顯微鏡下進(jìn)行檢測(cè)，挑選含分裂相好及完整染色體數(shù)的細(xì)胞片子放置于4 ℃冰箱以備使用。

1.3 熒光原位雜交分析

FISH技術(shù)參見Han等[10]方法。選擇FISH效果好的細(xì)胞用Cellsens Standard攝像系統(tǒng)照相。為獲得準(zhǔn)確可靠的結(jié)果，鏡檢挑選10個(gè)分裂相較好且經(jīng)熒光原位雜交后染色清晰的細(xì)胞用于構(gòu)建FISH核型圖及雜交信號(hào)分布特點(diǎn)分析。

2 結(jié)果與分析

該試驗(yàn)利用pAs 1與pSc 119.2-1 2種具不同顏色的重復(fù)序列探針對(duì)普通小麥貴紫麥1號(hào)的根尖細(xì)胞染色體開展一次熒光原位雜交(圖1)并建立其FISH核型(圖2)。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，貴紫麥1號(hào)包括21對(duì)染色體，探針pAs 1在D基因組上發(fā)現(xiàn)明顯的紅色雜交信號(hào)，在A基因組染色體上大部分存在明顯信號(hào)，在B基因組染色體上也存在微弱信號(hào)；而探針pSc 119.2-1于B基因組上發(fā)現(xiàn)明顯綠色雜交信號(hào)，于A基因組與D基因組上部分有明顯信號(hào)。結(jié)合染色體長(zhǎng)度，及以上2種探針基本上可以對(duì)A、B基因組及D基因組完成準(zhǔn)確辨別。

2.1 貴紫麥1號(hào)A基因組的FISH分析

貴紫麥1號(hào)的1 A染色體短臂的端部具有1對(duì)微弱的pAs 1信號(hào)。2 A染色體短臂端部具有明亮的pAs 1信號(hào)，其近著絲點(diǎn)處具有微弱的pAs 1信號(hào)；在長(zhǎng)臂的端部具有1對(duì)微弱的pSc 119.2-1信號(hào)。3 A染色體短臂靠近著絲點(diǎn)處具有1對(duì)明亮的pAs 1信號(hào)。4 A長(zhǎng)臂的端部具有1對(duì)微弱的pAs 1信號(hào)及1對(duì)微弱的pSc 119.2-1信號(hào)。5 A染色體長(zhǎng)臂中間具有1對(duì)微弱的pAs 1 信號(hào)，在染色體短臂端部及靠近著絲點(diǎn)處各具有1對(duì)微弱的pSc 119.2-1信號(hào)。6 A染色體中有一條染色體長(zhǎng)臂的端部發(fā)現(xiàn)非常微弱的pAs 1信號(hào)，而另一條卻未發(fā)現(xiàn)明顯的pAs 1信號(hào)，推測(cè)信號(hào)在雜交過程中丟失。7 A染色體在接近著絲點(diǎn)及長(zhǎng)臂處具有若干微弱的pAs 1信號(hào)。

注：紅色為pAs 1雜交信號(hào)，綠色為pSc 119.2-1雜交信號(hào)，細(xì)胞經(jīng)DAPI染色呈藍(lán)色。下同。圖1 普通小麥貴紫麥1號(hào)染色體的熒光原位雜交圖

圖2 普通小麥(貴紫麥1號(hào)) 的A、B基因組和D基因組的FISH核型

2.2 貴紫麥1號(hào)B基因組的FISH分析

與A基因組相比，出現(xiàn)在B基因組中的pSc 119.2-1信號(hào)明顯較多且明亮。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，貴紫麥1號(hào)的1 B和6 B染色體含有隨體。貴紫麥1號(hào)的1 B染色體長(zhǎng)臂末端具有1對(duì)較強(qiáng)的pSc 119.2-1信號(hào)，此外，其長(zhǎng)臂中部還具有1對(duì)微弱的pSc 119.2-1信號(hào)以及1對(duì)微弱的pAs 1信號(hào)。2 B染色體長(zhǎng)臂中部具有1對(duì)較強(qiáng)的pSc 119.2-1信號(hào)。3 B染色體短臂末端及長(zhǎng)臂中間上各發(fā)現(xiàn)1對(duì)微弱的pAs 1信號(hào)，在其短臂端部還發(fā)現(xiàn)1對(duì)微弱的pSc 119.2-1信號(hào)。4 B染色體上發(fā)現(xiàn)較多且明亮的pSc 119.2-1信號(hào)，相比其它染色體來看較容易被區(qū)分出來，在其短臂末端、長(zhǎng)臂中間與末端都顯示出了很明亮的探針pSc 119.2-1雜交信號(hào)。5 B染色體的短臂末端、中間與長(zhǎng)臂中間處都顯示出較明亮的pSc 119.2-1雜交信號(hào)，在其短臂末端還具有1對(duì)微弱的pAs 1信號(hào)，但被同位置的pSc 119.2-1信號(hào)覆蓋。6 B染色體上2種探針信號(hào)都較為豐富，其短臂末端及接近著絲點(diǎn)處均具有微弱的pAs 1信號(hào)，長(zhǎng)臂末端、中部和短臂末端都發(fā)現(xiàn)了較強(qiáng)的pSc 119.2-1信號(hào)。7 B染色體的兩末端均發(fā)現(xiàn)微弱的pAs 1信號(hào)，在長(zhǎng)臂的末端、中部與短臂接近末端處也發(fā)現(xiàn)微弱的pSc 119.2-1信號(hào)。

2.3 貴紫麥1號(hào)D基因組的FISH分析

相比A基因組和B基因組，探針pAs 1在D基因組上不僅信號(hào)豐富且明亮，還可有效地對(duì)D基因組進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分。貴紫麥1號(hào)在1 D染色體短臂末端以及長(zhǎng)臂中部分別發(fā)現(xiàn)較強(qiáng)的pAs 1信號(hào)，其短臂末端還發(fā)現(xiàn)1個(gè)較明亮的pSc 119.2-1信號(hào)。2 D染色體的短臂末端與長(zhǎng)臂均發(fā)現(xiàn)豐富且較強(qiáng)的pAs 1信號(hào)，其短臂末端還發(fā)現(xiàn)1對(duì)微弱的pSc 119.2-1信號(hào)。3 D染色體的短臂末端具有強(qiáng)且大的pAs 1信號(hào)，同位置還具有1個(gè)較為明亮的pSc 119.2-1信號(hào)，在其長(zhǎng)臂端部還具有1對(duì)明亮的pAs 1信號(hào)。4 D染色體的長(zhǎng)臂中部與接近近著絲點(diǎn)處均具有面積大且略為強(qiáng)的pAs 1信號(hào)。5 D染色體的pAs 1信號(hào)較為豐富，其長(zhǎng)臂分布著多個(gè)明亮的pAs 1信號(hào)，在短臂末端與接近著絲點(diǎn)處都具有較強(qiáng)的pAs 1信號(hào)。6 D染色體的兩端分別具有較強(qiáng)較大的pAs 1信號(hào)，在長(zhǎng)臂近著絲點(diǎn)處也具有明亮的pAs 1信號(hào)。7 D染色體兩端也分布著較強(qiáng)較大的pAs 1信號(hào)。

2.4 貴紫麥1號(hào)與硬粒小麥(AABB)的FISH核型比較分析

將貴紫麥1號(hào)與陳星灼等[11]報(bào)道的硬粒小麥的A、B組染色體的雜交信號(hào)分布特點(diǎn)進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，貴紫麥1號(hào)的2 A染色體長(zhǎng)臂端部較硬粒小麥要多出1對(duì)微弱的pSc 119.2-1信號(hào)。貴紫麥1號(hào)的5 A染色體短臂末端及長(zhǎng)臂接近著絲點(diǎn)處均較硬粒小麥要多出1對(duì)微弱的pSc 119.2-1信號(hào)。硬粒小麥的2 B染色體長(zhǎng)臂末端具有1對(duì)明亮的pSc 119.2-1信號(hào)，而貴紫麥1號(hào)在相同位置卻沒有顯示出pSc 119.2-1信號(hào)。貴紫麥1號(hào)3 B染色體的短臂末端僅有1對(duì)微弱的pSc 119.2-1信號(hào)，硬粒小麥在相同位置卻顯示出2對(duì)明亮的pSc 119.2-1信號(hào)。貴紫麥1號(hào)的5 B染色體長(zhǎng)臂近著絲點(diǎn)發(fā)現(xiàn)1對(duì)微弱的pSc 119.2-1信號(hào)，而在硬粒小麥中未曾發(fā)現(xiàn)任何信號(hào)。

2.5 貴紫麥1號(hào)與節(jié)節(jié)麥(DD)的FISH核型比較分析

貴紫麥1號(hào)跟HuaKun Zhang等[12]所研究的節(jié)節(jié)麥D組染色體的FISH結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明，兩者的pAs 1信號(hào)基本相似，僅在1 D染色體上節(jié)節(jié)麥的長(zhǎng)臂端部比貴紫麥1號(hào)多出1對(duì)明顯的pAs 1信號(hào)。兩者的pSc 119.2-1信號(hào)分布則表現(xiàn)出了部分差異，貴紫麥1號(hào)的1 D染色體的短臂末端較節(jié)節(jié)麥多出1個(gè)明亮的pSc 119.2-1信號(hào)，節(jié)節(jié)麥的4 D短臂末端與5 D短臂末端均比貴紫麥1號(hào)多出1對(duì)pSc 119.2-1 信號(hào)。

2.6 貴紫麥1號(hào)與中國(guó)春(AABBDD)的FISH核型比較分析

貴紫麥1號(hào)與Tang等[9]報(bào)道的pAs 1、pSc 119.2-1探針在中國(guó)春A、B基因組及D基因組染色體上的雜交信號(hào)基本相似，卻又存在部分雜交信號(hào)差異。發(fā)現(xiàn)貴紫麥1號(hào)的2 A染色體的長(zhǎng)臂末端以及5 A長(zhǎng)臂靠近著絲點(diǎn)位置均比中國(guó)春多具有1對(duì)pSc 119.2-1信號(hào)。貴紫麥1號(hào)的6 B染色體短臂末端較中國(guó)春多出1對(duì)pSc 119.2-1信號(hào)。貴紫麥1號(hào)的7 B染色體長(zhǎng)臂末端發(fā)現(xiàn)1對(duì)pSc119.2-1信號(hào)，而中國(guó)春上并沒有。貴紫麥1號(hào)的1 D染色體短臂末端較中國(guó)春要多出1個(gè)pSc 119.2-1信號(hào)。

3 討 論

建立植物染色體核型在植物遠(yuǎn)緣雜交育種中具有十分重要的意義，不僅可以對(duì)其染色體數(shù)目及形態(tài)結(jié)構(gòu)變異進(jìn)行研究，還能更深一步的探尋物種起源與進(jìn)化的關(guān)系[13]。Linc等[14]利用pSc 119.2與Afa family 2個(gè)mcFISH探針不僅成功辨別長(zhǎng)穗偃麥草E基因組所有染色體，還建立了詳細(xì)FISH核型模式圖，此外還將11個(gè)中國(guó)春-偃麥草二體附加系完成明確鑒定。BADAEVA 等[15]利用pAs 1及pSc 119.2兩個(gè)重復(fù)序列作探針，成功創(chuàng)立4套單芒山羊草的FISH核型。劉成等[16]先利用多聚核苷酸探針Oligo- pTa 535-1和Oligo- pSc 119.2-1成功辨別中國(guó)春-智利大麥雙二倍體的42條染色體，再結(jié)合(GAA)8探針有效鑒別出智利大麥染色體同源群。董磊等[17]運(yùn)用2個(gè)寡核苷酸探針Oligo-pTa 535及Oligo-pSc 119.2，對(duì)5份不同來源擬斯卑爾脫山羊草開展熒光原位雜交研究，成功鑒別所有染色體且構(gòu)建出各相應(yīng)材料清晰FISH核型圖；并通過比較發(fā)現(xiàn)，Oligo-pSc 119.2雜交信號(hào)在這些材料上的分布特征不僅與在小麥B基因組上的分布有顯著差異，在不同來源的斯卑爾脫山羊草材料間也表現(xiàn)出信號(hào)分布差異，說明高度重復(fù)序列Oligo-pSc 119.2探針在不同材料間表現(xiàn)出遺傳多樣性。宮文萍等[18]采用Oligo-pTa 535-1及Oligo-pSc 119.2-1兩個(gè)多聚核苷酸探針成功建立7份濟(jì)麥系列小麥的標(biāo)準(zhǔn)FISH核型圖，發(fā)現(xiàn)其信號(hào)分布特點(diǎn)與中國(guó)春大部分相似，但在染色體4 A、6 B、7 B和7 D上卻出現(xiàn)信號(hào)分布差異；此外還發(fā)現(xiàn)7份材料間的FISH信號(hào)變異位點(diǎn)相似，猜測(cè)可能是由于濟(jì)麥系列小麥的遺傳基礎(chǔ)較為狹小所導(dǎo)致。王丹蕊等[19]開發(fā)了包含pAs 1-1、pAs 1-3、AFA-4、(GAA)10和pSc 119.2-1共5個(gè)探針的寡核苷酸探針套，并利用該套探針對(duì)18份不同的中國(guó)春小麥非整倍體材料及5份親緣物種材料進(jìn)行一次熒光原位雜交(FISH)，不僅成功鑒別出相應(yīng)的中國(guó)春端體、中國(guó)春缺體及中國(guó)春四體材料，還能有效識(shí)別出不同物種材料，建立了相應(yīng)材料的清晰FISH核型圖，說明該套探針在不同材料間具有多態(tài)性，為后續(xù)研究應(yīng)用提供參考。

本研究利用pAs 1與pSc 119.2-1兩個(gè)不同顏色的重復(fù)序列探針對(duì)貴紫麥1號(hào)進(jìn)行1次熒光原位雜交分析，準(zhǔn)確辨別了其全部21對(duì)染色體，并建立貴紫麥1號(hào)的清晰FISH核型圖。貴紫麥1號(hào)染色體中的pAs 1信號(hào)相對(duì)要多些，并且在部分染色體上雜交信號(hào)面積大且較強(qiáng)；pSc 119.2-1信號(hào)則相對(duì)要少且弱。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，貴紫麥1號(hào)的FISH核型與陳星灼等[11]報(bào)道的硬粒小麥A、B基因組染色體的FISH信號(hào)分布特點(diǎn)、HuaKun Zhang等[12]報(bào)道的節(jié)節(jié)麥的D組染色體的FISH信號(hào)分布特點(diǎn)及Tang等[9]報(bào)道的pAs 1、pSc 119.2-1探針在中國(guó)春A、B基因組及D基因組各對(duì)染色體上分布的雜交信號(hào)基本相似，卻又存在部分雜交信號(hào)差異；可能是因?yàn)镈NA重復(fù)序列在各個(gè)小麥材料間存在遺傳差異及多態(tài)性而顯示出的部分雜交信號(hào)差異。貴紫麥1號(hào)是從節(jié)節(jié)麥/偏凸山羊草/硬粒小麥遠(yuǎn)緣雜交后代中自主創(chuàng)制的紫粒小麥新品種，不排除在該材料形成過程中有其他外源基因的進(jìn)入，亦可能是該材料在形成過程中經(jīng)歷過幾次染色體的組成與結(jié)構(gòu)變異現(xiàn)象，由此引起了染色體重復(fù)序列的改變，表現(xiàn)出了FISH雜交信號(hào)分布的多態(tài)性[20]。通過建立貴紫麥1號(hào)的FISH核型，為該材料下一步在細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)研究上將相關(guān)優(yōu)良性狀定位在染色體上具有重要的意義。