徐 淼張倩男楊 輝 * 張立實(shí) 賈旭東*

( 1．四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院，四川 成 都 610041；2．衛(wèi)生部食品安全風(fēng)險(xiǎn)評估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評估中心，北京 100021 )

亞硝胺是環(huán)境中常見的一類化學(xué)致癌物，在食物、飲用水、煙草、酒精飲料、化妝品中廣泛存在。就食源性污染而言，亞硝胺常源于熏肉、烤肉、咸魚等肉類食品的加工；此外，膳食攝入的硝酸鹽和亞硝酸鹽能夠在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)閬喯醢穂1-2]。 我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《GB 2760-2014 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》允許硝酸鹽、亞硝酸鹽作為食品添加劑在食品工業(yè)中使用，隨著其使用量日益增加，亞硝胺體內(nèi)暴露水平相應(yīng)地也會潛在增加。亞硝胺能夠在不同種屬動物中誘發(fā)腫瘤，但目前關(guān)于其致癌性的人體研究資料不足。越來越多的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，世界不同地區(qū)人群的食管癌和胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與亞硝胺及前體化合物的膳食攝入量密切相關(guān)[3-6]。因此，作為一種重要的食源性危害因素，亞硝胺致癌效應(yīng)及暴露水平研究資料的更新積累對于我國人群亞硝胺及前體化合物的食用安全風(fēng)險(xiǎn)評估至關(guān)重要。本文就亞硝胺致癌效應(yīng)研究進(jìn)展及國內(nèi)外相關(guān)食品安全管理現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 亞硝胺的來源

1.1 外源性攝入

食品生產(chǎn)加工過程和保藏方式如添加防腐劑、熏制、腌制等是亞硝胺食品污染的主要來源[7]。硝酸鹽和亞硝酸鹽是被廣泛使用的防腐劑、護(hù)色劑，常用于加工類肉食品的制作和保藏，它們是亞硝胺的主要前體化合物。常見的烹調(diào)方式如油炸、煎制、煙熏等易使食物中的胺類化合物發(fā)生亞硝化作用產(chǎn)生亞硝胺[8]。例如，油炸和煎制可使干腌香腸中亞硝胺的含量增加30%[8]；熏肉尤其是培根經(jīng)烹調(diào)后亞硝基化合物(N-nitroso compounds，NOC)可達(dá)到10～100 μg/kg，日本煙熏魚肉中二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine，NDMA)甚至超過100 μg/kg[9]。使用燃燒煙氣干燥麥芽、香辛料時也可產(chǎn)生亞硝胺，用麥芽發(fā)酵的啤酒中NDMA含量可高達(dá)70 μg/L[9]。有調(diào)查顯示，我國廣東地區(qū)2016年市售臘腸總揮發(fā)性亞硝胺含量為1.85～15.32 μg/kg[10]。此外，腌制和鹽制蔬菜或肉制品等儲存不當(dāng)時，天然食材中的硝酸鹽會經(jīng)微生物還原為亞硝酸鹽，繼而可能促進(jìn)亞硝胺的形成[7，11]。

1.2 內(nèi)源性合成

除食品添加劑外，在蔬菜、奶類、魚類、肉類中等食物中存在較多天然的硝酸鹽、亞硝酸鹽、氮類等亞硝胺前體化合物。這些前體物在人體胃酸環(huán)境中可與蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生的胺類化合物作用形成NDMA、亞硝酰胺等亞硝基化合物[1，9]。因此，硝酸鹽、亞硝酸鹽的膳食攝入可能導(dǎo)致亞硝胺的人體內(nèi)暴露水平潛在增加，但目前缺乏相應(yīng)的人群研究資料。體外模擬胃腸道生理?xiàng)l件的動態(tài)模型研究顯示，人體攝入10倍每日容許攝入量(acceptable daily intake，ADI)的硝酸鹽和100 g的魚肉，即使胃液pH緩慢變化，內(nèi)源性NDMA水平仍可達(dá)到43 μg[2]，遠(yuǎn)高于外源性攝入水平。根據(jù)世界癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)報(bào)告(2010年)，經(jīng)口攝入的硝酸鹽或亞硝酸鹽在內(nèi)源性亞硝化作用下可能對人體造成致癌效應(yīng)。2015年，我國上海的一項(xiàng)人群隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與尿液中硝酸鹽水平顯著相關(guān)，而且尿液中NOC水平與膳食中腌制蔬菜的攝入量具有明顯的劑量依賴關(guān)系[12]。

2 亞硝胺的致癌效應(yīng)

2.1 動物致癌性試驗(yàn)研究

IARC早在1987年就將某些種類亞硝胺(如二甲基亞硝胺、二乙基亞硝胺)列為2A類致癌物(對實(shí)驗(yàn)動物致癌性證據(jù)充分，但對人類致癌性證據(jù)有限)。動物試驗(yàn)研究表明，亞硝胺類化合物幾乎可以誘發(fā)所有臟器腫瘤，但以消化系統(tǒng)腫瘤最為常見。長久以來，學(xué)術(shù)界已利用亞硝胺的致癌性構(gòu)建了多種動物腫瘤模型用于癌癥研究。例如，通過給ICR小鼠腹腔注射35 mg/kg二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)每周1次，連續(xù)8周，40周時經(jīng)組織病理確定的肝細(xì)胞癌發(fā)生率為37.5%[13]； Marcelo等[14]研究者利用DEN的致癌性，每周前4天通過飲用水給予40 mg/L的DEN，持續(xù)180 d，小鼠胃癌的發(fā)生率可達(dá)63%；本實(shí)驗(yàn)室利用甲基芐基亞硝胺(N-methyl-benzyl-nitrosamine，NMBA)建立大鼠食管癌模型，0.5 mg/kg頸部皮下注射，每周3次，連續(xù)5周，第10周時腫瘤發(fā)生率為50%，至25周時腫瘤發(fā)生率為100%[15]。

2.2 人群流行病學(xué)研究

2012年全球發(fā)病率前10位的癌癥中包含3種消化道腫瘤：結(jié)腸癌(第3位)、胃癌(第5位)、食管癌(第8位)；而在我國這3種消化道腫瘤占總癌癥新發(fā)病例的1/3，其中食管癌和胃癌的發(fā)病人數(shù)分別占全球病例的49%和43%[16]。病因?qū)W分析表明，導(dǎo)致胃癌的主要危險(xiǎn)因素除幽門螺旋桿菌感染外，還來自飲食，特別是腌菜和烤肉、熏肉的攝入[17]。同樣，此類食物的膳食攝入量較高也是誘發(fā)食管鱗狀上皮細(xì)胞癌的重要危險(xiǎn)因素之一。

近年來，亞硝胺及其前體化合物的膳食暴露與消化道腫瘤發(fā)病的相關(guān)性得到了學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。胃液中亞硝基化合物及其前體物含量較高可能是致胃癌發(fā)病的重要原因。一項(xiàng)歐洲的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性NOC的生成可能是非賁門胃癌的危險(xiǎn)因素[18]，而2011年在英國的隊(duì)列研究結(jié)果表明胃腸道癌癥特別是直腸癌的發(fā)病率升高與內(nèi)源性NOC無關(guān)而與NDMA膳食暴露有關(guān)[5]。在荷蘭完成的大型前瞻性隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，NDMA和亞硝酸鹽的膳食暴露水平與食管鱗癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[6]。北美地區(qū)的病例對照研究提示，NDMA的膳食暴露可能增加結(jié)腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[19]。同樣，我國東南沿海、河南林縣等地區(qū)食管癌發(fā)病率較高也可能與人群亞硝胺暴露水平較高有關(guān)[20]。

有學(xué)者對亞硝胺暴露與消化道腫瘤的相關(guān)性研究進(jìn)行了Meta分析。Ren等[17]搜集了東亞國家的人群研究，通過分析發(fā)現(xiàn)食用腌制食品可顯著增加胃癌的風(fēng)險(xiǎn)，喜食腌制食物較不常食用腌制食物的人群患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)增加了近50%，尤其是在中國和韓國。崔娟等[4]分析了1980～2012年的隊(duì)列研究，發(fā)現(xiàn)NDMA膳食暴露可顯著增加消化道腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。Song等[3]發(fā)現(xiàn)硝酸鹽與亞硝酸鹽、亞硝胺對胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有不同效應(yīng)，高硝酸鹽攝入可在一定程度上降低胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，這可能是因?yàn)橄跛猁}主要來源于蔬菜，而蔬菜富含膳食纖維、維生素C及其他抗氧化劑，可減少致癌性NOC形成；但膳食高攝入亞硝酸鹽、NDMA可增加胃癌風(fēng)險(xiǎn)，與崔娟等[4]研究結(jié)果一致。

3 亞硝胺致癌機(jī)制研究進(jìn)展

3.1 傳統(tǒng)的致癌機(jī)制研究

自然界中存在300多種亞硝胺，因結(jié)構(gòu)(對稱、非對稱及環(huán)狀)和代謝特征的差異使其致癌性表現(xiàn)出明顯的組織特異性，但一般認(rèn)為其共同的作用機(jī)制通常包括3個生物學(xué)過程：①亞硝胺在靶器官或組織中代謝活化生成烷基化陽離子；②DNA烷基化造成遺傳損傷并誘導(dǎo)修復(fù)；③DNA修復(fù)無效導(dǎo)致基因突變及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。例如，NMBA能夠特異性誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生食管鱗癌，它在動物體內(nèi)經(jīng)代謝活化后最終形成甲基正碳離子(CH3+)，與DNA作用后形成加合物O6-甲基鳥嘌呤和7-甲基鳥嘌呤。當(dāng)DNA甲基化加合物無法被甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)有效清除時，可以造成RAS、P53等基因突變并最終誘發(fā)癌癥[21]。少量樣本的人體研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中O6-甲基鳥嘌呤含量顯著高于正常組織，而且與病人的硝酸鹽和亞硝胺膳食攝入量密切相關(guān)[22]。

3.2 可能的新機(jī)制——炎癥微環(huán)境塑造

雖然傳統(tǒng)觀念認(rèn)為亞硝胺的致突變性是其致癌效應(yīng)的重要分子機(jī)制，但這一“細(xì)胞內(nèi)”(intracellular)反應(yīng)并非其誘發(fā)腫瘤的唯一決定因素。近年來，越來越多的研究證明慢性炎癥反應(yīng)在腫瘤發(fā)展的不同階段均起到了關(guān)鍵作用[23]。炎癥反應(yīng)源于機(jī)體免疫應(yīng)答，組織微環(huán)境中浸潤的免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生動態(tài)、廣泛而長久的相互影響，共同塑造炎癥微環(huán)境并最終決定癌癥結(jié)局。炎癥微環(huán)境已經(jīng)被證實(shí)為腫瘤形成的必要條件，特別是在消化道腫瘤中[24]。在亞硝胺致消化道腫瘤的有害結(jié)局路徑(adverse outcome pathway，AOP)中，起始分子事件(molecular initiating events，MIEs)除正碳離子導(dǎo)致的DNA烷基化外還包含氧自由基(ROS)、氮自由基(RNS)產(chǎn)生的DNA氧化損傷和蛋白氧化修飾[25]。氧化應(yīng)激信號途徑的激活能夠促使細(xì)胞分泌趨化因子、啟動免疫應(yīng)答，繼而誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生有利(組織修復(fù))抑或有害(炎癥損傷)反應(yīng)[26]。利用體外腸細(xì)胞模型進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，不同種類的亞硝胺暴露使氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)信號通路顯著激活[27]。炎性細(xì)胞浸潤可產(chǎn)生ROS、RNS進(jìn)而增加DNA損傷，導(dǎo)致細(xì)胞生存(cell survival)或抗凋亡(anti-apoptotic)信號通路激活和癌基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，促進(jìn)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化。另一方面，炎癥微環(huán)境中免疫細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素(IL-1，IL-6，IL-17，IL-23)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、腫瘤生長因子(TGF-β)、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)等細(xì)胞因子能夠進(jìn)入基質(zhì)細(xì)胞并激活某些核轉(zhuǎn)錄因子(NF-kB、STAT3、AP-1等)，從而促進(jìn)局部血管生成以及腫瘤細(xì)胞增殖、遷移或侵襲[28]。“細(xì)胞外”免疫響應(yīng)過程與傳統(tǒng)認(rèn)識中的“細(xì)胞內(nèi)”反應(yīng)的相互關(guān)系，以及腫瘤微環(huán)境中上皮細(xì)胞與免疫細(xì)胞如何相互作用等問題有待深入研究。

3.3 影響亞硝胺致癌性的其他因素

動物實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)研究表現(xiàn)，維生素C(vitamin C，VC)和維生素E(vitamin E，VE)能夠阻斷亞硝胺的合成，從而可能降低消化道腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。早在1986年就有研究報(bào)道，VC和VE可抑制亞硝化作用從而減少亞硝胺合成。一項(xiàng)意大利的病例對照研究發(fā)現(xiàn)，VC、VE的攝入可降低NOC所導(dǎo)致的胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。另一巢式病例對照研究同樣表明，機(jī)體維生素C水平對于NDMA膳食暴露的致癌效應(yīng)(尤其是直腸癌)可能具有顯著影響[5，18]。

相反，某些膳食營養(yǎng)元素缺乏可能促進(jìn)亞硝胺的致癌效應(yīng)。Fong等[29]發(fā)現(xiàn)，膳食中鋅缺乏可能會促進(jìn)NMBA對大鼠食管的致癌效應(yīng)，而補(bǔ)充鋅則可促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，延緩腫瘤進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)室通過動物模型模擬了我國林縣人群VE和硒營養(yǎng)缺乏狀態(tài)對NMBA誘發(fā)食管癌的促進(jìn)作用，并證實(shí)了膳食補(bǔ)充VE和硒的化學(xué)預(yù)防作用[15]。由此可見，食物與營養(yǎng)對于亞硝胺的致癌風(fēng)險(xiǎn)具有重要影響，而補(bǔ)充微量營養(yǎng)元素可能是預(yù)防消化道腫瘤的有效方法[30]。

4 亞硝胺相關(guān)的食品安全標(biāo)準(zhǔn)

2016年，IARC已將加工肉類食品(processed meat)列為1類致癌物。亞硝胺作為該類食品的重要污染物之一，針對其制訂有關(guān)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)并實(shí)施監(jiān)管，對于減少食源性危害，保護(hù)人群健康具有重要意義。美國農(nóng)業(yè)部規(guī)定，肉制品中總揮發(fā)性亞硝胺不得超過10 μg/kg；FDA規(guī)定了麥芽中NDMA含量不超過10 ppm，而麥芽飲料中不得超過5 ppm。我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《GB 2762-2012 食品中污染物限量》規(guī)定了蔬菜、飲用水、乳類及特殊用途食品等食品中亞硝胺、亞硝酸鹽和硝酸鹽的殘留限量，例如肉制品(肉類罐頭除外)中NDMA不得超過3.0 μg/kg，水產(chǎn)制品(水產(chǎn)品罐頭除外)不得超過4.0 μg/kg。

(亞)硝酸鈉、(亞)硝酸鉀是常用于肉制品、海產(chǎn)品的防腐劑、護(hù)色劑，是加工肉制品中亞硝酸鹽的主要來源。國際食品法典委員會(Codex Alimentarius Commission，CAC)規(guī)定加工畜禽肉制品時亞硝酸鹽的最大使用量為80 mg/kg。日本對于硝酸鉀、硝酸鈉作為肉制品護(hù)色劑的使用限量標(biāo)準(zhǔn)為70 mg/kg，亞硝酸鈉作為肉制品護(hù)色劑則要求使用后亞硝酸鹽殘留量不超過5 mg/kg。我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《GB 2760-2014 食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》對硝酸鹽、亞硝酸鹽的使用也作出了明確的限量規(guī)定，如硝酸鈉、硝酸鉀作為護(hù)色劑、防腐劑使用時，腌臘肉制品類最大使用量為0.5 g/kg，亞硝酸鈉、亞硝酸鉀最大使用量為150 mg/kg，殘留限量不得超過30 mg/kg。

5 亞硝胺及前體化合物的暴露評估

目前，亞硝胺人體暴露評估大多是通過檢測食物中最常見的類型NDMA來實(shí)現(xiàn)，但由于內(nèi)暴露尚未引起足夠重視，而且相應(yīng)的檢測分析方法尚不完善，因此亞硝胺內(nèi)源性暴露水平的研究資料非常有限。世界衛(wèi)生組織(WHO)2002年報(bào)告顯示，NDMA的人體暴露主要來自食物的加工處理或保藏過程，成人(20～59歲)通過食物的暴露量為4.3～11 ng/(kg·d)；這一暴露評估主要基于加拿大人群的食物攝入量和NDMA污染水平進(jìn)行估算[7]。2009年，美國學(xué)者通過調(diào)查問卷分析得到NOC膳食暴露水平范圍為0.001～15 μg/d[31]。有研究者根據(jù)NDMA誘發(fā)肝臟腫瘤的毒性效應(yīng)利用基準(zhǔn)劑量法(Benchmark dose，BMD)推算出其每日耐受攝入量(tolerable d aily i ntake，TDI)為4.0～9.3 n g/(kg·d)[32]。雖然研究資料有限，但可以推斷亞硝胺的總體外暴露水平很可能超出人體耐受攝入量從而增加癌癥風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)于亞硝胺前體物，2003年WHO提出的硝酸鹽每日容許攝入量(ADI)為3.7 mg/kg，亞硝酸鹽為0.07 mg/kg?；谟邢薜难芯抠Y料，WHO報(bào)告顯示硝酸鹽、亞硝酸鹽的人群暴露水平不太可能超過ADI[33]。但是，由前體化合物內(nèi)源性合成亞硝胺的實(shí)際內(nèi)暴露水平尚不清楚，其食品安全風(fēng)險(xiǎn)評估資料更是缺乏。Zeilmaker等[34]利用體外腸細(xì)胞模型推算了荷蘭人群的NDMA內(nèi)暴露水平[成人0.4 ng/(kg·d)]，并推斷同時攝入魚和硝酸鹽高含量的蔬菜可能增加癌癥風(fēng)險(xiǎn)。

6 問題與展望

近年來，亞硝酸鹽、硝酸鹽作為食品添加劑在食品工業(yè)中廣泛使用，亞硝胺總體膳食暴露水平可能相應(yīng)地潛在增加，但目前缺乏完整的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測和暴露評估資料。亞硝胺致癌效應(yīng)機(jī)制尚未完全明確，亞硝胺及其前體化合物與人體消化道腫瘤的相關(guān)性還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。亞硝胺的人體內(nèi)暴露水平及健康影響效應(yīng)仍缺乏準(zhǔn)確的生物標(biāo)志物和監(jiān)測方法。作為一種重要的食源性危害因素，亞硝胺的人體膳食暴露水平、機(jī)體內(nèi)暴露水平及其致癌效應(yīng)研究資料的更新積累對于我國人群亞硝胺、(亞)硝酸鹽的食品安全風(fēng)險(xiǎn)評估至關(guān)重要。

另一方面，亞硝胺致癌性受其遺傳毒性和機(jī)體穩(wěn)態(tài)平衡的共同作用。利用現(xiàn)代毒理學(xué)技術(shù)研究亞硝胺致癌效應(yīng)中機(jī)體免疫細(xì)胞行為、發(fā)現(xiàn)毒性通路中關(guān)鍵分子事件并探索靶向干預(yù)措施成為該領(lǐng)域內(nèi)的重要研究方向，也將為消化道腫瘤的化學(xué)預(yù)防、減少疾病負(fù)擔(dān)提供科學(xué)支持。

在食品生產(chǎn)加工方面，從源頭上減少硝酸鹽、亞硝酸鹽的使用或?qū)で筇娲穼⑹菧p少其膳食暴露的有效途徑。目前，已有許多研究在尋找可部分或完全替代亞硝酸鹽的添加劑或能夠阻斷亞硝胺產(chǎn)生的物質(zhì)，例如紅曲色素(發(fā)色劑)、乳酸鏈球菌素(防腐劑)、茶多酚(抗氧化劑)、姜蒜汁和α-生育酚(亞硝胺生成阻斷劑)[35]。但(亞)硝酸鹽在肉制品生產(chǎn)過程中仍是廣泛使用的食品添加劑，未來應(yīng)加強(qiáng)對此類替代品的應(yīng)用及安全性研究。

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