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大豆異黃酮對(duì)阿特拉津損傷SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制

2018-02-05 10:43吳浩宇
癌變·畸變·突變 2018年1期
關(guān)鍵詞:異黃酮姜黃培養(yǎng)液

李 鵬 ,馬 焜,吳浩宇,

吳艷萍,李百祥*

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室,黑龍江 哈 爾濱 150081)

阿特拉津(atrazine,ATR)是一種含氯的均三氮苯類除草劑。其價(jià)格低廉、低毒且除草效果好而被世界廣泛應(yīng)用??稍诘乇砘虻叵滤懈患ㄟ^(guò)食物鏈蓄積,對(duì)機(jī)體多個(gè)臟器產(chǎn)生不同程度的損害,包括生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng),具有致癌、致畸和內(nèi)分泌干擾性[1-5]。就其神經(jīng)毒性而言,表現(xiàn)為紋狀體多巴胺(dopamine,DA)含量降低,黑質(zhì)致密區(qū)酪氨酸脫氫酶(tyrosine hydroxylase,TH)陽(yáng)性細(xì)胞減少,引起機(jī)體出現(xiàn)類似帕金森(Parkinson,PD)的病理和行為表現(xiàn)[6-7]。研究表明,ATR致DA神經(jīng)系統(tǒng)的損傷主要是通過(guò)誘發(fā)氧化應(yīng)激,提高活性氧濃度[8],而天然植物化合物具有抗氧化、抗炎的作用。已有研究表明大豆異黃酮、槲皮素、茶多酚、姜黃素和白藜蘆醇可以抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[9-13]。因此本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),選取人神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y細(xì)胞,神經(jīng)細(xì)胞的一種),對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng),比較大豆異黃酮、槲皮素、茶多酚、姜黃素和白藜蘆醇5種植物化合物抗ATR的DA 神經(jīng)元損傷作用,為有效預(yù)防和治療PD藥物開發(fā)及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 人神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞株,購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。

1.1.2 試劑與儀器 阿特拉津(CAS號(hào)1912-24-9,99.7%,南京都萊生物技術(shù)有限公司);DMEM高糖培養(yǎng)液,購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;青霉素,鏈霉素購(gòu)于哈藥集團(tuán);胎牛血清購(gòu)于以色列Beit-Haemek公司;胰蛋白酶購(gòu)于南京碧云天公司;CCK-8購(gòu)于日本Dojindo公司;BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京碧云天公司;大豆異黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、茶多酚購(gòu)于北京標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)中心;姜黃素購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;抗-TH多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa公司;β-actin購(gòu)于美國(guó)Immuno Way公司;堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)于北京中杉金橋;Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司;活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京白云天公司;超凈工作臺(tái)購(gòu)于蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;CO2培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Thermo公司;低溫高速離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)HERMLE公司;酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司;凝膠圖像分析儀購(gòu)于美國(guó)Gold-SIM公司;流式細(xì)胞分析儀購(gòu)于美國(guó)BD公司;激光掃描共聚焦顯微鏡購(gòu)于日本尼康公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將SH-SY5Y細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞活力檢測(cè) 在前期研究中,已經(jīng)證明ATR以時(shí)間和劑量依賴的方式降低SH-SY5Y細(xì)胞的活力,ATR染毒的細(xì)胞在24 h的半數(shù)致死量(LD50)為250μmol/L[12],在本研究中,使用250 μmol/L ATR作進(jìn)一步的研究。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL,在無(wú)菌96孔培養(yǎng)板中按每孔100 μL加入細(xì)胞懸浮液,37 ℃孵箱中培養(yǎng)24 h后,棄去培養(yǎng)基,分別加入含大豆異黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、茶多酚、姜黃素的培養(yǎng)液,各植物化合物的濃度梯度均為5、10、20、50、100 μmol/L。培養(yǎng)24 h后,棄培養(yǎng)基,用PBS洗3次,加入濃度為250 μmol/L的ATR培養(yǎng)液。另設(shè)ATR組(含250 μmol/L ATR的細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL于細(xì)胞培養(yǎng)48 h后加入),對(duì)照組(細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL),每組設(shè)9個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后,吸棄培養(yǎng)液,每孔加入含10μL C CK-8的細(xì)胞培養(yǎng)液,培養(yǎng)2 h 后,用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)的吸光度D(450)值。

細(xì)胞相對(duì)活力(%)=[(D(450)對(duì)照孔- D(450)實(shí)驗(yàn)孔) /(D(450)對(duì)照孔-D(450)空白孔)]×100%

實(shí)驗(yàn)孔:含有細(xì)胞的培養(yǎng)液、CCK-8、藥物;對(duì)照孔:含有細(xì)胞的培養(yǎng)液、CCK-8、不含藥物;空白孔:不含細(xì)胞和藥物的培養(yǎng)液、CCK-8。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL,接種于6孔板培養(yǎng),每孔含細(xì)胞懸浮液2 mL。細(xì)胞分組和處理同1.2.2。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞,PBS洗2次,PBS重新懸浮細(xì)胞并計(jì)數(shù),取含5×105/mL的細(xì)胞懸液,1 000 r/min離心5 min后棄上清液,加入500 μL的結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞,加入5 μL Annexin V-FITC混勻后,加入5 μL碘化丙啶(PI),混勻,室溫、避光反應(yīng)15 min,用流式細(xì)胞儀檢測(cè),激發(fā)波長(zhǎng)488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)530 nm。

1.2.4 活性氧自由基(ROS)的檢測(cè) 根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果,5 μmol/L大豆異黃酮對(duì)ATR 損傷SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)效果最好,故選取5 μmol/L大豆異黃酮作進(jìn)一步研究。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL,接種于24孔板(板內(nèi)含有直徑1 cm的圓形蓋玻片),每孔含細(xì)胞懸液0.5 mL。37 ℃孵箱中培養(yǎng)24 h后,棄去培養(yǎng)基,加入5 μmol/L大豆異黃酮培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h,棄掉培養(yǎng)基,用PBS洗3次,加入濃度為250 μmol/L的ATR培養(yǎng)液。另設(shè)ATR組(含250μmol/L ATR的細(xì)胞培養(yǎng)液),空白對(duì)照組(不經(jīng)任何處理的細(xì)胞組)。培養(yǎng)24 h后,棄去原有培養(yǎng)液,加入含有DAPI的PBS 1 mL,37 ℃孵箱中孵育30 min,PBS洗3次,加入含有10 μmol/L DCFH-DA探針的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液1 mL,37 ℃孵箱中孵育20 min。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌3次,以充分除去未進(jìn)入細(xì)胞的DCFHDA。用鑷子夾取圓形蓋玻片倒放在載玻片上,適當(dāng)風(fēng)干后,封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光標(biāo)記的細(xì)胞并拍照。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)TH蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng),24 h后,加入含濃度為5 μmol/L大豆異黃酮的細(xì)胞培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h后,棄掉培養(yǎng)基,用PBS洗3次,加入濃度為250 μmol/L的ATR培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h后、收集細(xì)胞,加蛋白裂解液、低溫高速離心機(jī)收集蛋白,用BCA測(cè)定蛋白濃度,計(jì)算蛋白加樣量。進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn),步驟簡(jiǎn)述如下:凝膠垂直放置于室溫下,待基層膠聚合完全(20~30 min),加入分離膠,插入梳子待其凝固,移出梳子。將凝膠板置于電泳裝置上,加入電泳液進(jìn)行電泳(80 V,20 min;120 V,60 min)。當(dāng)marker充分分離后,關(guān)閉電源,將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,58 V恒壓轉(zhuǎn)膜,4 ℃,70 min。轉(zhuǎn)膜后與一抗反應(yīng),4 ℃過(guò)夜。第2天將PVDF膜取出,TBST洗膜3次,每次5 min,與堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗搖床孵育1 h,TBST洗膜2次,每次5 min,TBS洗膜1次,每次5 min。顯影,將蛋白圖像掃描到電腦上,通過(guò)Licor-odyssey軟件進(jìn)行定量分析,結(jié)果以蛋白的相對(duì)量表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活力檢測(cè)

CCK-8法檢測(cè)大豆異黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、茶多酚、姜黃素5種植物化合物對(duì)ATR作用下的SHSY5Y細(xì)胞活力,結(jié)果見圖1。與對(duì)照組(100%)相比,ATR組細(xì)胞相對(duì)活力為43.57%±7.95%。與ATR組相比,白藜蘆醇在5 μmol/L、槲皮素在50 μmol/L、姜黃素在5 μmol/L、茶多酚在20 μmol/L、大豆異黃酮在5μmol/L處可顯著提高細(xì)胞相對(duì)活力(P<0.05)。大豆異黃酮在5~100 μmol/L范圍內(nèi)細(xì)胞活力隨劑量增加逐漸降低,但在同一劑量下均高于ATR組和其他4種植物化合物組,在5 μmol/L處細(xì)胞活力最高,細(xì)胞相對(duì)活力為81.47%±4.75%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 5種植物化合物對(duì)ATR作用下的SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

2.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果見表2,可見與對(duì)照組相比,ATR組細(xì)胞凋亡率為19.83%±1.81%。與ATR組相比,白藜蘆醇在10 μmol/L、槲皮素在50 μmol/L、姜黃素在5 μmol/L、茶多酚在20 μmol/L、大豆異黃酮在5μmol/L處可顯著抑制細(xì)胞凋亡,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。總體而言,5種植物化合物在低劑量范圍內(nèi)可有效減少ATR對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的損傷,在5 μmol/L處,姜黃素和大豆異黃酮效果最好,但是大豆異黃酮相比姜黃素而言,制作成本低且原材料豐富易獲取。故選取5 μmol/L大豆異黃酮作進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

圖2 5種植物化合物對(duì)ATR作用下的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

2.3 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)

激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果見圖3,可見經(jīng)250μmol/L ATR染毒后24 h,SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度明顯增加。5 μmol/L大豆異黃酮預(yù)培養(yǎng)24 h,細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度減弱。說(shuō)明大豆異黃酮可拮抗ATR,減少細(xì)胞內(nèi)ROS的生成。

2.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TH的表達(dá)量

Western blot檢測(cè)結(jié)果見圖4。通過(guò)Licor-odyssey軟件定量分析,250 μmol/L ATR染毒后24 h,與空白組比較,SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)TH蛋白的表達(dá)量下降,經(jīng)5μmol/L大豆異黃酮提前處理24 h,可增加細(xì)胞內(nèi)TH蛋白的表達(dá)量,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而大豆異黃酮與ATR聯(lián)合組的TH表達(dá)量與空白組相當(dāng)(P>0.05),說(shuō)明大豆異黃酮可減輕ATR對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的損傷。

圖3 5 μmol/L大豆異黃酮和ATR處理24 h后對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

圖4 5 μmol/L大豆異黃酮和ATR處理24 h后對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)TH表達(dá)量的影響

3 討論

阿特拉津作為一種廣泛使用的含氯均三氮苯類除草劑,化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,不易降解,可通過(guò)生物蓄積增加人類接觸的危險(xiǎn)性。所以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面,大面積使用ATR,用于殺滅雜草的同時(shí),也對(duì)糧食和食品構(gòu)成了潛在的威脅,增加了人體接觸的機(jī)會(huì),造成不易察覺的亞急性或慢性損害。研究發(fā)現(xiàn),ATR具有神經(jīng)毒性,可以干擾突觸小泡與突觸體的相互作用,影響突觸小泡存儲(chǔ)和攝取多巴胺,導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病[14-16],如PD。同時(shí)ATR可劑量依賴性的減少紋狀體內(nèi)多巴胺及其代謝產(chǎn)物的水平并減少酪氨酸羥化酶陽(yáng)性多巴胺神經(jīng)元的數(shù)目[17-18]。因此尋找副作用小、能夠有效預(yù)防及改善ATR對(duì)多巴胺能神經(jīng)損傷的藥物,了解其機(jī)制,成為研究熱點(diǎn)。研究表明大豆異黃酮、槲皮素、白藜蘆醇、茶多酚、姜黃素5種植物化合物具有神經(jīng)保護(hù)作用,為了比較5種植物化合物對(duì)ATR所致SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,在本研究中,我們選用CCK-8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡率。結(jié)果表明,5種植物化合物在低劑量范圍內(nèi),可以有效的減少ATR對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的損傷,相比較其他4種植物化合物而言,大豆異黃酮可以顯著增加SH-SY5Y細(xì)胞的活力,抑制細(xì)胞凋亡,尤其在5 μmol/L處,效果最佳。

神經(jīng)細(xì)胞死亡且不可再生,造成細(xì)胞死亡的主要原因之一是氧化應(yīng)激,產(chǎn)生大量的ROS,ROS 通過(guò)激活細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)信號(hào)通路,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,也可導(dǎo)致呼吸鏈?zhǔn)軗p,減少ATP的產(chǎn)生,進(jìn)一步增加ROS,降低線粒體膜電位,導(dǎo)致促凋亡蛋白Bax的激活和細(xì)胞色素C的釋放[19-21]。 Ma等[8]的研究表明ATR通過(guò)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化增加ROS的表達(dá),從而增加其對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的損傷。Astrid等[10]的研究表明大豆異黃酮可以減少β-淀粉樣蛋白在轉(zhuǎn)基因線蟲中造成的氧化應(yīng)激。本研究結(jié)果表明,ATR可以增加細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)水平,大豆異黃酮可以抗ATR減少細(xì)胞內(nèi)ROS的生成,說(shuō)明大豆異黃酮可以減少ATR引起的氧化應(yīng)激損傷。

TH作為多巴胺合成的限速酶,在多巴胺合成的調(diào)節(jié)過(guò)程中起著重要的作用。馬琨等[22]的研究表明ATR對(duì)大鼠黑質(zhì)區(qū)DA能神經(jīng)元有明顯的損傷作用,可以減少黑質(zhì)區(qū)TH的表達(dá)。本研究結(jié)果表明,ATR可以減少TH的表達(dá),大豆異黃酮可以拮抗ATR增加TH的表達(dá),說(shuō)明大豆異黃酮可以有效的減少ATR引起的DA能神經(jīng)元的損傷死亡。

綜上所述,5種植物化合物中,大豆異黃酮抗ATR,對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)效果最好且能有效減少細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,增加TH的表達(dá)。為尋找有效的神經(jīng)保護(hù)藥物提供依據(jù),為PD的預(yù)防指明了方向。

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中國(guó)環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì)舉行第7次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨第17次學(xué)術(shù)大會(huì)

中國(guó)環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì)第7次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨第17次學(xué)術(shù)大會(huì)于2017年12月6—8日在上海舉行,來(lái)自全國(guó)各地近四百位會(huì)員代表出席了大會(huì)。

學(xué)術(shù)大會(huì)以“環(huán)境誘變劑與人群健康和疾病”為主題,通過(guò)主會(huì)場(chǎng)、分會(huì)場(chǎng)和墻報(bào)交流的形式,展示了我國(guó)相關(guān)領(lǐng)域的最新研究成果,使參會(huì)代表了解到國(guó)內(nèi)外的研究進(jìn)展和發(fā)展動(dòng)向。有12名學(xué)者獲青年優(yōu)秀論文獎(jiǎng),8名學(xué)者獲優(yōu)秀壁報(bào)獎(jiǎng)。本次學(xué)術(shù)大會(huì)為推進(jìn)后備人才的成長(zhǎng),促進(jìn)我國(guó)在環(huán)境誘變劑與人群健康和疾病領(lǐng)域的研究發(fā)展,更好地發(fā)揮學(xué)會(huì)服務(wù)國(guó)家和社會(huì)的功能作出了貢獻(xiàn)。

12月8日下午第7次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)舉行,學(xué)會(huì)副理事長(zhǎng)兼秘書長(zhǎng)郝衛(wèi)東教授代表第6屆理事會(huì)作了工作報(bào)告。報(bào)告指出,中國(guó)環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì)第6屆理事會(huì)于2012年11月經(jīng)會(huì)員代表大會(huì)選舉產(chǎn)生,歷時(shí)5年。5年中,在中國(guó)科協(xié)的全面指導(dǎo)下、在掛靠單位北大醫(yī)學(xué)部的支持下、在理事會(huì)和廣大會(huì)員的積極參與下,學(xué)會(huì)在組織建設(shè)、學(xué)術(shù)交流、期刊出版、科普宣傳、人才隊(duì)伍建設(shè)等方面得到持續(xù)、穩(wěn)定、健康的發(fā)展,已成為發(fā)展和壯大我國(guó)環(huán)境誘變劑領(lǐng)域研究,推動(dòng)我國(guó)經(jīng)濟(jì)、環(huán)境與社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的重要力量。

大會(huì)通過(guò)了學(xué)會(huì)第6屆理事會(huì)工作報(bào)告、學(xué)會(huì)章程修改報(bào)告、學(xué)會(huì)財(cái)務(wù)工作報(bào)告、監(jiān)事會(huì)工作條例。會(huì)議以無(wú)記名投票方式,選舉產(chǎn)生了第7屆理事會(huì)、第1屆監(jiān)事會(huì)。隨后召開了第7屆理事會(huì)第1次會(huì)議,選舉產(chǎn)生了常務(wù)理事會(huì)及學(xué)會(huì)領(lǐng)導(dǎo)人,通過(guò)了學(xué)會(huì)名譽(yù)理事長(zhǎng)提名。第7屆理事會(huì)理事長(zhǎng)曹佳教授聘任郝衛(wèi)東教授為學(xué)會(huì)秘書長(zhǎng),郝衛(wèi)東秘書長(zhǎng)確定了副秘書長(zhǎng)人選。會(huì)議還選舉產(chǎn)生了新的中國(guó)環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì)黨委。

第7屆理事會(huì)理事長(zhǎng)曹佳教授代表學(xué)會(huì)領(lǐng)導(dǎo)班子表示,感謝全體理事的信任。黨的十九大對(duì)廣大科學(xué)工作者提出了更高的要求,也提供了更加廣闊的舞臺(tái)。讓我們認(rèn)真學(xué)習(xí)和貫徹習(xí)近平新時(shí)代中國(guó)特色社會(huì)主義思想,努力開創(chuàng)學(xué)會(huì)工作的新局面。

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