劉萌萌，李彥文，周慶彪，張佳欣，王樂樂，劉江正，于衛(wèi)華，孔德欽，

劉 瑞，海春旭，張曉迪*

（空軍軍醫(yī)大學軍事預防醫(yī)學系毒理學教研室，陜西 西 安 710032）

氯氣廣泛用于冶金、紙漿漂白、紡織、染料、橡膠、塑料等工業(yè)生產(chǎn)，由于管理不善或操作不當所導致的群體性急性中毒事件時有發(fā)生[1]。肺臟是氯氣發(fā)揮毒效應的第一靶器官，高濃度氯氣可深入肺泡，引起急性肺損傷(acute lung injury，ALI），目前缺乏救治藥物。研究顯示，線粒體在氯氣引起的II型肺泡上皮細胞損傷中發(fā)揮重要作用，并能影響整個細胞的功能，從而加重ALI[2]，提示改善線粒體功能可能是治療氯氣致ALI的有效途徑。PINK1/Parkin是線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)的關(guān)鍵蛋白，通過影響自噬、離子運輸和ATP產(chǎn)量等作用，保護線粒體的完整性[3-4]。紅景天苷是一種苯丙素糖苷，自紅景天中提取，具有提高運動耐力、抗疲勞、預防高原反應、促進血液循環(huán)、清除機體毒素和治療各種地方病等藥理作用。本研究在深入觀察氯氣致肺血管內(nèi)皮細胞損傷的基礎上，探討紅景天苷對氯氣暴露致大鼠急性肺損傷發(fā)生中線粒體功能的干預作用，為氯氣中毒的臨床救治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

氯氣購自常州市京華氣體有限公司。二辛可寧酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒和超微量ATPase測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；組織線粒體分離試劑盒購于生工生物工程(上海)股份有限公司；Tom20鼠多克隆抗體、COX IV兔多克隆抗體、PINK1兔多克隆抗體和Parkin兔多克隆抗體均為美國Santa Cruz Biotechnology產(chǎn)品；β-actin鼠多克隆抗體購于美國Sigma公司；動式染毒柜為天津合普科技有限公司產(chǎn)品。紅景天苷購自西安易樂生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物與飼養(yǎng) 實驗動物購自第四軍醫(yī)大學動物實驗中心，實驗動物許可證號為SCXK(陜)2014-002。成年雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量為 (200±20) g，飲用自來水，墊料為鋸末，12 h/12 h明暗交替，在染毒前12 h禁食不禁水。

1.2.2 動物分組和處理 36只雄性SD大鼠，氯氣暴露前1 d，隨機分為6組：分別為未染毒組，以及氯氣染毒后0.5、1.5、3、6和9 h組。各染毒組被置于染毒柜中給予氯氣1 200 mg/m3暴露處理5 min，未染毒組(給予空氣)單獨放入干凈染毒柜中，5 min后取出，在相應時間取材，腹腔注射2%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉大鼠，腹主動脈取血，后行氣管插管，結(jié)扎右側(cè)支氣管，左肺進行肺泡灌洗。將未灌洗的右肺整體取出，右肺中葉用于病理切片制備，其余肺組織置-80 ℃ 保存待用。另外24只雄性SD大鼠，隨機分為4組：氯氣暴露組，紅景天苷干預組，陰性對照組和紅景天苷對照組；氯氣暴露組和紅景天苷干預組氯氣染毒條件同上，其余2組未進行染毒處理。紅景天苷干預組和紅景天苷對照組均于染毒前30 min和染毒后15 min各給予1次300 mg/kg紅景天苷灌胃，陰性對照組和氯氣暴露組給予等量生理鹽水灌胃，3 h后取材。

1.2.3 乳酸脫氫酶(LDH）、Na+, K+- ATP酶及Ca2+, Mg2+-ATP酶活力的測定 左肺灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)和全血 2 000 r/min離心10 min，分裝后嚴格按照試劑盒操作步驟，測定LDH活力、Na+, K+-ATP 酶及Ca2+, Mg2+-ATP酶活力，其余部分于-80 ℃保存。

1.2.4 Western blot檢測PINK1、Parkin和Tom20蛋白表達 取100 mg肺組織，剪碎后置于勻漿器中，加1 mL裂解液，勻漿后置于冰上裂解30 min，14 770 r/min 離心20 min，取上清，其中 20 μL用于蛋白定量，其余分別加入等體積2×SDS上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min，將樣品進行分裝，-80 ℃保存，Western blot測定PINK1、Parkin和Tom20蛋白表達，使用Quantity One灰度分析軟件進行半定量。

1.2.5 肺組織細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察 取右肺中葉，4%戊二醛固定肺組織，二甲砷酸緩沖液沖洗后脫

水、環(huán)氧樹脂浸透、包埋、超薄切片，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染，透射電鏡下觀察肺血管內(nèi)皮細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)改變。

1.2.6 肺組織線粒體的提取 準確稱取200 mg肺組織，PBS沖洗干凈，加入線粒體分離試劑后勻漿器勻漿，1 000 r/min離心10 min，取上清，11 000 r/min、4℃離心10 min，棄上清，沉淀即線粒體。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，-實驗結(jié)果用x±s 表示，組間比較使用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 Tukey’s multiple comparison test檢驗。檢驗水準為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 氯氣暴露引起B(yǎng)ALF中LDH活力升高

LDH的檢測結(jié)果見圖1，與未染毒組相比，氯氣暴露處理不同時間后，大鼠BALF中LDH活力均明顯升高，其差均異具有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)。

圖1 氯氣暴露后大鼠BALF中LDH的變化

2.2 氯氣暴露影響線粒體相關(guān)蛋白表達

Western blot法檢測肺組織中線粒體相關(guān)蛋白Tom20、PINK1及Parkin表達結(jié)果見圖2。與未染毒組相比，Tom20、PINK1及Parkin蛋白表達水平均升高，差異均具有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05，Tom20蛋白9 h組除外)。與其他組別相比，染毒后3 h組Tom 20蛋白表達量最高(P＜0.05)，故選取3 h作為后續(xù)實驗時間節(jié)點。

2.3 氯氣致肺血管內(nèi)皮細胞線粒體結(jié)構(gòu)變化

圖2 氯氣染毒不同時間后大鼠肺組織線粒體相關(guān)蛋白Tom20、PINK1及Parkin表達變化

透射電鏡檢測大鼠肺血管內(nèi)皮細胞結(jié)果見圖3。陰性對照組肺組織血管內(nèi)皮細胞線粒體(圖3A、B)形態(tài)正常，線粒體呈卵圓形或桿狀，分布密集，內(nèi)嵴清晰且排列整齊，嵴內(nèi)腔未見擴張，基質(zhì)均勻一致，未見線粒體腫脹及空泡變性。氯氣暴露后3 h(圖3C)，肺組織血管內(nèi)皮細胞線粒體透光度不均，嵴排列紊亂，甚至溶解消失，基質(zhì)疏松，線粒體腫脹明顯且空泡變性(圖3D)。

2.4 紅景天苷對肺組織線粒體相關(guān)蛋白的干預作用

圖3 透射電鏡下大鼠肺血管內(nèi)皮細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)改變

Western blot檢測肺組織線粒體相關(guān)蛋白結(jié)果如圖4。氯氣暴露后3 h，大鼠肺組織PINK1和Parkin蛋白表達上調(diào)，與氯氣暴露組相比，紅景天苷可降低PINK1和Parkin蛋白表達水平(P＜0.05)。

2.5 紅景天苷對線粒體PINK1和Parkin的干預作用

圖4 紅景天苷對肺組織PINK1、Parkin蛋白表達的干預作用

PINK1和Parkin主要在線粒體上發(fā)揮作用，進一步測定了線粒體中PINK1和Parkin的蛋白表達水平，結(jié)果見圖5。與陰性對照組相比，氯氣暴露后，線粒體中PINK1蛋白表達上調(diào)(P＜0.05)，Parkin蛋白表達下降(P＜0.05)；與氯氣暴露組比較，紅景天苷干預能夠顯著降低線粒體PINK1蛋白表達(P＜0.05)，升高Parkin蛋白表達水平(P＜0.05)。

2.6 紅景天苷對肺組織ATP酶活力的干預作用

定磷法檢測ATPase活力結(jié)果見圖6。與陰性對照組相比，氯氣損傷后 3 h，引起肺組織Na+, K+-ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶活力升高(P＜0.05)。紅景天苷干預可顯著使其活性降低(P＜0.05)。

2.7 紅景天苷對血清LDH活力的干預作用

大鼠血清LDH活力變化情況如圖7。氯氣染毒后3 h，氯氣暴露組LDH活力顯著高于陰性對照組(P＜0.05)；與氯氣暴露組相比，紅景天苷干預可顯著降低因氯氣損傷引起的LDH活力異常(P＜0.05)。提示紅景天苷對氯氣致急性肺損傷具有保護作用。

3 討論

氯氣是一種刺激性氣體，進入機體后，常與黏膜和呼吸道的水作用生成氯化氫和新生態(tài)氧，引起上呼吸道黏膜炎性水腫、充血和壞死[5]。氯氣中毒至今缺乏有效救治藥物，瓶頸問題是中毒機制不清楚。本研究在大鼠染毒實驗中發(fā)現(xiàn)，氯氣損傷后可致肺血管內(nèi)皮細胞線粒體受損，線粒體相關(guān)蛋白表達呈現(xiàn)時間效應關(guān)系，并且染毒后3 h變化顯著。結(jié)合文獻[6-8]報道，推測在氯氣致大鼠急性肺損傷過程中，線粒體損傷可能是其發(fā)生的重要環(huán)節(jié)和損傷機制。線粒體是真核細胞內(nèi)重要的氧化代謝場所，其膜上的呼吸酶類可通過電子傳遞鏈傳遞電子，消耗O2，產(chǎn)生ATP。生理狀態(tài)下，線粒體傳遞電子是高效的，僅有少量電子漏出，形成ROS。有研究報道，氯氣暴露后，次級代謝產(chǎn)物Cl/HClO/ClO-可直接作用于線粒體，損傷電子2鏈，引起內(nèi)源性ROS增多，并且消耗抗氧化物質(zhì)，導致氧化應激[9]。本研究發(fā)現(xiàn)氯氣損傷過程中線粒體結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)生顯著變化，這種變化是否是由過多的ROS所導致的，尚需進一步實驗驗證。紅景天苷被認為是紅景天中最有效成分[10]，分子式為C H O，親水14 20 7強，不易透過組織生物膜[11]，半衰期短，與組織有較高的親和性，可提高機體對氧的利用系數(shù)和對缺氧的耐受性，起到保護肺組織和心血管的作用[11]。紅景天苷還是良好的抗氧化劑，能夠清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化物形成，延緩細胞的退行性變化。本文嘗試應用紅景天苷這種優(yōu)良的抗氧化劑驗證改善氧化損傷的同時，是否可修復線粒體損傷。

圖5 紅景天苷對肺組織線粒體中PINK1和Parkin蛋白表達的干預作用

圖6 紅景天苷對肺組織ATP酶活力的干預作用

圖7 紅景天苷對大鼠血清LDH水平的干預作用

PTEN誘導假定激酶1 (PINK1)是一種核編碼的絲/蘇氨酸激酶，在細胞質(zhì)中產(chǎn)生，轉(zhuǎn)位至線粒體發(fā)揮作用[12-13]。當細胞發(fā)生應激時，PINK1轉(zhuǎn)位至線粒體外膜，以一種磷酸化的作用方式偶聯(lián)Parkin，從而維持線粒體膜的完整性和膜電位的穩(wěn)定。PINK1/Parkin是線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)因子[12，14]，具有保護細胞線粒體的功能。由于線粒體是細胞內(nèi)主要的產(chǎn)能細胞器，因此PINK1/Parkin對于細胞的活性也至關(guān)重要。PINK1的變異會導致激酶活力下降，影響自噬、氧化磷酸化和糖酵解水平[15-16]，Parkin可以與線粒體DNA 直接結(jié)合，保護線粒體 DNA并激發(fā)線粒體的自我修復過程[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，氯氣暴露引起肺組織PINK1與Parkin蛋白表達水平升高，這可能與線粒體數(shù)量增加有關(guān)；氯氣暴露引起線粒體PINK1轉(zhuǎn)位水平升高，偶聯(lián)Parkin下降，線粒體自噬水平下降，這與Zhang等[18]的研究結(jié)果一致，原因可能是受損線粒體增多，機體清除率下降[19]；紅景天苷干預可有效降低線粒體PINK1轉(zhuǎn)位水平，升高線粒體Parkin水平，說明紅景天苷可保護線粒體，這與張偉等[20]的研究結(jié)果一致，原因可能是，紅景天苷通過維持PINK1和Parkin功能，促進失活線粒體的降解，抑制因氯氣暴露引起的線粒體數(shù)量升高。

肺泡表面存在ATP依賴的Na+, K+- ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶，在ALI進程中發(fā)揮重要作用[21]。氯氣暴露后，次級代謝產(chǎn)物進入細胞直接作用于線粒體，干擾氧化磷酸化過程，引起ATP產(chǎn)量下降，影響ATPase 活性，導致肺泡離子運輸紊亂。肺泡上皮的Na+, K+-ATP 酶，將Na+離子從肺泡腔轉(zhuǎn)移到肺泡間質(zhì)，當肺泡上皮輕微受損時，Na+, K+-ATP酶被激活，可在一定程度上限制肺水腫的程度[22]， 隨著損傷加重，Na+, K+-ATP酶逐漸失活。Ca2+, Mg2+-ATP酶與鈣穩(wěn)態(tài)失衡密切相關(guān)。氯氣暴露后，ATP能量供應異常，Ca2+, Mg2+-ATP酶功能異常，引起細胞外Ca2+內(nèi) 流和細胞質(zhì)Ca2+超載，引起離子代謝紊亂，導致肺水腫。本研究觀察到，氯氣暴露引起ATP酶活力升高，離子運輸紊亂，這與Qin等[21]結(jié)果一致，紅景天苷干預可顯著降低ATP酶水平，提示紅景天苷對線粒體有保護作用。

LDH存在于人體各組織器官中，是機體能量代謝中的一種重要酶，其質(zhì)與量的改變，直接影響到機體的能量代謝。當機體各組織器官病變時，其組織器官本身的LDH活力發(fā)生改變，并且可引起血液中LDH活力改變，因此LDH活力的改變反映了機體受損的程度。氯氣暴露后，肺組織LDH被釋放進入血清和BALF中，LDH活力水平可間接反映肺損傷程度。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氯氣暴露引起LDH活力升高，紅景天苷能夠有效抑制LDH活性的升高，提示紅景天苷可有效保護氯氣引起的大鼠ALI。

綜上所述，氯氣暴露引起大鼠肺血管內(nèi)皮細胞線粒體受損，致細胞供能障礙，肺血管功能異常，進而導致急性肺損傷。紅景天苷可改善氯氣所致的大鼠ALI，其機制除了改善氧化損傷外，還可能通過抑制線粒體過度增殖，同時促進受損線粒體的清除來發(fā)揮作用。本研究為紅景天苷藥物藥效學研究及氯氣中毒的有效救治提供了基礎數(shù)據(jù)與理論依據(jù)，為紅景天苷的藥物開發(fā)提供了有意義的參考。

[1] Van SICKLE D，WENCK M A，BELFLOWER A，et al. Acute health effects after exposure to chlorine gas released after a train derailment[J]. Am J Emerg Med，2009，27(1)：1-7.

[2] JURKUVENAITE A，BENAVIDES G A，KOMAROVA S，et al. Upregulation of autophagy decreases chlorine gas induced mitochondrial injury and lung inflammation[J]. Free Radic Biol Med，2015，85：83-94.

[3] DEAS E，PLUN-FAVREAU H，WOOD N W. PINK1 function in health and disease[J]. Embo Mol Med，2009，1(3)：152-165.

[4] SCARFFE L A，STEVENS D A，DAWSON V L，et al. Parkin and PINK1：much more than mitophagy[J]. Trends Neurosci，2014，37(6)：315-324.

[5] 張曉迪，趙琰，李文麗，等. 紅景天苷對氯氣致大鼠肺損傷的保護作用[J]. 預防醫(yī)學情報雜志，2013，29(4)：269-272.[6] 尚濤，李立萍，張建新. 線粒體與急性肺損傷[J]. 河北醫(yī)藥，2007，29(4)：367-369.

[7] ISLAM M N，DAS S R，EMIN M T，et al. Mitochondrial transfer from bone-marrow-derived stromal cells to pulmonary alveoli protects against acute lung injury[J]. Nat Med，2012，18(5)：759-765.

[8] 焦光宇，畢濤，高鴻美，等. 內(nèi)毒素對大鼠膈肌收縮功能及線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2008，31(6)：431-435.

[9] 劉萌萌，孔德欽，鄒遠康，等. 紅景天苷對氯氣暴露致急性肺損傷肺血管通透性的保護作用[J]. 癌變·畸變·突變，2016，28(5)：377-382.

[10] ZHONG H，XIN H，WU L X，et al. Salidroside attenuates apoptosis in ischemic cardiomyocytes：a mechanism through a mitochondria-dependent pathway[J]. J Pharmacol Sci，2010，114(4)：399-408.

[11] 章娟. 大花紅景天質(zhì)量控制和相關(guān)成分藥代動力學研究[D].沈陽：沈陽藥科大學，2008.

[12] VALENTE E M，ABOU-SLEIMAN P M，CAPUTO V，et al.Hereditary early-onset Parkinson's disease caused by mutations in PINK1[J]. Science，2004，304(5674)：1158-1160.

[13] BEILINA A，Van Der BRUG M，AHMAD R，et al. Mutations in PTEN-induced putative kinase 1 associated with recessive parkinsonism have differential effects on protein stability[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102(16)：5703-5708.

[14] KITADA T，ASAKAWA S，HATTORI N，et al. Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism[J]. Nature，1998，392(6676)：605-608.

[15] GEGG M E，COOPER J M，SCHAPIRA A H，et al. Silencing of PINK1 expression affects mitochondrial DNA and oxidative phosphorylation in dopaminergic cells[J]. PLoS One，2009，4(3)：e4756.

[16] MORAIS V A，VERSTREKEN P，ROETHIG A，et al.Parkinson’s disease mutations in PINK1 result in decreased complex I activity and deficient synaptic function[J]. Embo Mol Med，2009，1(2)：99-111.

[17] ROTHFUSS O，F(xiàn)ISCHER H，HASEGAWA T，et al. Parkin protects mitochondrial genome integrity and supports mitochondrial DNA repair[J]. Hum Mol Genet，2009，18(20)：3832-3850.

[18] ZHANG H，MI L，WANG T，et al. PINK1/Parkin-mediated mitophagy play a protective role in manganese induced apoptosis in SH-SY5Y cells[J]. Toxicol in Vitro，2016，34：212-219.

[19] NARENDRA D P，JIN S M，TANAKA A，et al. PINK1 is selectively stabilized on impaired mitochondria to activate Parkin[J]. PLoS Biol，2010，8(1)：e1000298.

[20] 張偉，李濤，陳磊，等. 紅景天苷通過PINK1-Parkin通路在MPP+誘導的SH-SY5Y細胞中維持線粒體形態(tài)和功能[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2016，16(9)：1649-1653.

[21] QIN X，LI Y，LIANG X，et al. The dysfunction of ATPases due to impaired mitochondrial respiration in phosgene-induced pulmonary edema[J]. Biochem Bioph Res Co，2008，367(1)：150-155.

[22] MCMAHON S，CHARBONNEAU M，GRANDMONT S，et al.Transforming growth factor beta1 induces hypoxia-inducible factor-1 stabilization through selective inhibition of PHD2 expression[J]. J Biol Chem，2006，281(34)：24171-24181.