高曉潔 孔 璐* 薛玉英*

（1. 東 南大學公共衛(wèi)生學院，環(huán)境醫(yī)學工程教育部重點實驗室，江蘇 南 京 210009；2. 江 蘇省生物材料與器件重點實驗室，江蘇 南 京 210009）

納米鎳作為一種金屬納米材料，除具備納米粒子自身性質(zhì)之外，還具有一系列磁、電、光及力學等方面的新異特性，已經(jīng)被應用到各種消費產(chǎn)品和行業(yè)中，如催化劑、陶瓷、潤滑劑、涂料、電子和燃料[1]，在鎳氫電池、太陽能涂層、集成電路、靶向藥物載體、磁共振成像、腫瘤熱療、磁療保健產(chǎn)品等領(lǐng)域[1-2]具有廣泛的應用，使其通過不同途徑進入人體的機會大大增加，對機體的影響越來越引起人們的重視。研究[3-7]表明納米鎳可引起氧化應激、細胞毒性、細胞周期改變、細胞凋亡以及DNA損傷等反應。研究[8]還顯示納米材料的超微性使其可以輕松通過血睪屏障，引起生殖細胞損害。本課題組前期研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，納米鎳對大鼠和線蟲均具有生殖毒性作用，尤其對雄性大鼠生殖細胞具有明顯損害。研究[11-13]發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)，是一類長度一般超過200 nt的非蛋白編碼RNA，主要從表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等層面調(diào)控基因表達。LncRNA與生殖發(fā)育及細胞凋亡關(guān)系密切，但lncRNA在環(huán)境污染物所致生殖損傷中的作用及其機制研究報道極少。因此，本研究應用SD大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細胞作為研究對象，探討納米鎳對大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細胞凋亡的作用，以及凋亡相關(guān)lncRNA的表達變化。

1 材料與方法

1.1 材料

納米鎳，粒徑90 nm，產(chǎn)品代號FNiN-80，黑色粉體，純度99%，比表面積≥8 m3/g，松裝密度0.06～0.80 g/cm3，購自昆山密友納米科技有限公司。22～28 d齡SPF級雄性SD大鼠8只，每個實驗2只，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2013-0016。DMEM高糖培養(yǎng)液，購于美國GE公司；Schiff試劑，購于北京Solarbio科技有限公司，噻唑藍(MTT)購于美國Sigma公司，細胞凋亡-Hoechst染色試劑盒，購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。主要儀器：3423型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公 司 )， FSX型 生 物 導 航 儀 (日 本Olympus公司)，Epoch型酶標儀(美國Bio Tek公司)，F(xiàn)ACSCantoTMII流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 納米鎳的表征 使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制納米鎳溶液滴在銅網(wǎng)上，使用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡進行檢測，結(jié)果用Nano Measurer 1.2.5軟件分析納米鎳粒徑分布。

1.2.2 大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細胞的提取取22～28 d雄性SD大鼠2只，頸椎脫臼處死，75%乙醇消毒陰囊皮膚，取雙側(cè)睪丸，放入預冷的D-Hank’s液中。剝除睪丸被膜，將實質(zhì)剪碎成約1 mm3大小，加入D-Hank’s 液靜置3 min，用D-Hank’s液沖洗2遍后轉(zhuǎn)入三角燒瓶中。加0.25%的胰酶6 mL，37 ℃恒溫水浴振蕩30 min，至組織碎塊變成線索狀。加入少許血清終止消化，1 000 r/min離心5 min，2次。D-Hank’s液洗滌沉淀后加入0.1%膠原酶，37 ℃恒溫低速振蕩30 min。75 μm細胞篩過濾，將濾液800 r/min離心5 min，2次，用DMEM培養(yǎng)液洗滌，加入一定量培養(yǎng)液重懸沉淀物，吹打混勻。將細胞置于飽和濕度、37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中孵育[14]。

1.2.3 大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細胞的鑒定在Feulgen染色法的基礎(chǔ)上將鹽酸水解的濃度、溫度和時間進行了一定的改進。生精-支持共培養(yǎng)細胞接種于預置蓋玻片的6孔板中，將共培養(yǎng)細胞爬片用PBS浸洗2次，95%酒精室溫固定15 min，蒸餾水洗片。置于25℃、5 mol/L鹽酸中30 min，蒸餾水沖洗2 min。加入Schiff試劑，37 ℃恒溫箱放置50 min。0.5%偏重亞硫酸水洗3次，每次5 min。流水沖洗5 min，蒸餾水沖洗2 min。酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。生物導航儀下觀察結(jié)果，依據(jù)細胞形態(tài)鑒定生精細胞和支持細胞。

1.2.4 納米鎳染毒液的配制 設(shè)對照組與實驗組，對照組不做處理，實驗組分別加入不同濃度的納米鎳溶液。納米鎳染毒液配制方法如下：稱取一定量的納米鎳粉體，使用DMEM培養(yǎng)液配置成800 μg/mL 的儲備液，超聲(100 W)分散30 min后使用0.22 μm濾器(美國Millipore公司)過濾除菌，4 ℃保存1周使用。檢測前將納米鎳儲備液超聲分散30 min，使用DMEM培養(yǎng)液將儲備液分別稀釋到400、200、100、50和25 μg/mL。

1.2.5 MTT法檢測細胞存活率 將大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細胞接種于96孔板中，37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜。對照組加入細胞培養(yǎng)液，實驗組分別加入5、50、100、200、400和800 μg/mL納米鎳溶液，每組設(shè)定4個復孔。培養(yǎng)24 h后吸去染毒液，將MTT溶液使用不含血清的培養(yǎng)液稀釋至0.5 mg/mL，每孔加入200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清，每孔加入150 mL的DMSO，輕微振蕩，使結(jié)晶充分溶解。采用酶標儀測定490 nm處的吸光度D(490)值，計算細胞存活率，公式為：

細 胞 存 活 率(%)=[D(490)實驗組- D(490)空白組] /[D(490)對照組-D(490)空白組]×100%

1.2.6 Hoechst33258染色法檢測細胞凋亡形態(tài)將生精-支持共培養(yǎng)細胞接種于預置蓋玻片的6孔板中，37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜。對照組加入細胞培養(yǎng)液，實驗組分別加入25、50、100、200 μ g/mL納米鎳溶液，每組設(shè)定4個復孔。24 h 后，棄培養(yǎng)液，加入0.5 m L固定液，固定10 min或更長時間(可4 ℃過夜)。去除固定液，PBS洗兩次，每次3 m in。0.5 m L H oechst33258染液染色5 m in。去染色液，PBS洗兩次，每次3 min。滴1滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上已貼附細胞的蓋玻片，讓細胞接觸封片液。生物導航儀觀察細胞形態(tài)。

1.2.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將生精-支持共培養(yǎng)細胞接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，對照組加入細胞培養(yǎng)液，實驗組分別加入 25、50、100和200、400 μg/mL納米鎳溶液。每組4個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。染毒結(jié)束后，棄染毒液，PBS清洗2次，每孔加入300 μL不含EDTA的胰酶消化，1 min后加600 μL含10%胎牛血清培養(yǎng)液終止消化。細胞收集于EP管中，1 000 r/min離心10 min，用PBS洗滌細胞2次。將細胞懸浮于200 μL結(jié)合緩沖液中，加入5 μL的膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和5 μL碘化丙啶(PI)，輕輕混勻，進行雙染，室溫避光反應15 min。加入200 μL結(jié)合緩沖液，采用流式細胞儀檢測(激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為530 nm，Annexin V-FITC的綠色熒光通過FL1通道檢測，PI紅色熒光通過FL2通道檢測)。1.2.8 LncRNA表達譜芯片檢測 染毒24 h后，對照組和100 μg/mL納米鎳染毒組(根據(jù)細胞凋亡實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)100 μg/mL納米鎳染毒組的凋亡率與對照組比較有顯著性差異，但又不會產(chǎn)生過高毒性，符合基因芯片檢測要求)分別加入1 mL Trizol收集細胞；使用NanoDrop ND-1000分光光度計測D(260)/D(280)值，以評估總RNA的純度，使用標準變性瓊脂糖膠凝電泳檢測總RNA的完整性；送至上海高通生物科技有限公司進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

用Excel建立數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)用SPSS for Windows 20.0統(tǒng)計軟件進行處理。多組間的比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析(One-Way ANOVA)。劑量效應分析，采用兩變量直線相關(guān)分析(bivariate correlation)。進一步進行組間兩兩比較時，若方差齊，采用LSD-t檢驗；若方差不齊，采用Games-Howell檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 納米鎳表征結(jié)果

掃描電子顯微鏡觀察，納米鎳呈球形，粒徑在30～100 nm，有一定團聚。透射電子顯微鏡觀察，納米鎳呈規(guī)則球狀，粒徑分布不均勻，在25～125 nm ，有一定團聚。如圖1所示。

圖1 納米鎳電子顯微鏡觀察圖

2.2 Feulgen染色法鑒定生精-支持共培養(yǎng)細胞

Feulgen染色結(jié)果見圖2。如圖所示，支持細胞形狀不規(guī)則，胞體較大，胞核呈橢圓形，胞質(zhì)呈網(wǎng)狀，核仁區(qū)著色較淡，紫色的細胞核內(nèi)清晰可見染成深紫色的雙極小體；生精細胞呈圓形或卵圓形，胞核較大，胞質(zhì)極少，圓形或卵圓形的核占據(jù)了整個細胞體積的 90%。

2.3 納米鎳對大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細胞存活率的影響

不同濃度納米鎳染毒大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細胞24 h后細胞存活率變化如圖3所示。大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細胞暴露于不同劑量的納米鎳24 h后，細胞存活率呈現(xiàn)劑量依賴性下降(P＜0.01，r=0.784)。與對照組比較，所有劑量組細胞存活率均降低(P＜0.01)。

圖2 Feulgen染色法鑒定生精-支持共培養(yǎng)細胞(×200)

圖3 納米鎳染毒后大鼠生精-支持共培養(yǎng)細胞存活率的改變(，n=4)

2.4 納米鎳對SD大鼠生精-支持共培養(yǎng)細胞形態(tài)的影響

Hoechst33258染色后，在熒光顯微鏡下觀察，正常細胞的細胞核呈正常的藍色，細胞發(fā)生凋亡時，染色質(zhì)會固縮。所以染色時，細胞核會呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。如圖4所示，倒置顯微鏡下觀察，對照組細胞(圖4A)呈正常藍色，細胞核內(nèi)DNA分布相對均勻，細胞核無固縮，在視野中呈現(xiàn)體積較大的且染色顏色較淺的核形態(tài)。處理組細胞(圖4B、C、D、E)細胞核出現(xiàn)不同程度的固縮、染色質(zhì)聚集、邊緣化等典型的細胞凋亡核形態(tài)學改變。

2.5 納米鎳對大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細胞凋亡率的影響

如圖5所示，在Annexin V/PI雙染法流式檢測結(jié)果中，不同濃度納米鎳染毒大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細胞總凋亡率的改變見圖6。與對照組相比，染毒24 h后，隨著染毒劑量的升高，細胞凋亡率呈劑量依賴性增加(P＜0.01，r=0.844)：染毒劑量為25、50、100、200、400 μg/mL時，其凋亡率分別為8.80%±0.50%、11.00%±0.70%、12.53%±0.71%、15.95%±0.54%和17.80%±0.76%，且各劑量組細胞凋亡率與對照組(2.65%±0.74%)比較均明顯增加(P＜0.01)。

2.6 總RNA質(zhì)量檢測結(jié)果

對實驗組和對照組細胞樣品提取的總RNA進行吸光度D(260)值測定，樣本濃度分別為344.9和346.1 ng/μL，具體結(jié)果見表1，RNA總量及質(zhì)量符合lncRNA微陣列的檢測要求?？俁NA經(jīng)瓊脂糖電泳后，可見18 S和28 S兩條清晰的條帶(圖7)，證實已經(jīng)獲得高純度完整的總RNA。

圖4 Hoechst33258染色法觀察納米鎳對大鼠生精-支持共培養(yǎng)細胞形態(tài)的影響(×250)

圖5 Annexin V/PI雙染法檢測不同劑量納米鎳對大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細胞凋亡率的影響

圖6 納米鎳對大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細胞總凋亡率的影響(n=4，)

圖7 細胞總RNA瓊脂糖電泳結(jié)果

表1 總RNA質(zhì)量檢測結(jié)果

2.7 凋亡相關(guān)lncRNA挑選結(jié)果

基因芯片檢測結(jié)果顯示，涉及的凋亡相關(guān)通路有PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路、p53信號通路、MAPK信號通路、Gap junction信號通路、Hippo信號通路、Chemokine信號通路、TGF-beta信號通路，Protein processing in endoplasmic reticulum信號通路和Jak-STAT信號通路。其中，參與這些凋亡通路的lncRNA共169個，實驗組與對照組相比，上調(diào)的有117個，下調(diào)的有52個(倍數(shù)絕對值≥2.0，P≤0.05)。本研究在前期芯片檢測基礎(chǔ)上進一步構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡，結(jié)合生物信息學分析，從中挑選凋亡相關(guān)lncRNA，為進一步的功能及機制研究提供參考。

圖8 凋亡相關(guān)lncRNA-miRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡圖

3 討論

本文選擇大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細胞來研究納米鎳對睪丸細胞的凋亡作用，并以此為基礎(chǔ)進一步探討納米鎳生殖損害作用的分子機制問題。本研究首先建立大鼠睪丸生精-支持細胞原代共培養(yǎng)模型，并在Feulgen染色法基礎(chǔ)上進行一定的改進，對生精-支持共培養(yǎng)細胞進行鑒定分析，發(fā)現(xiàn)本研究所建立的生精-支持細胞體系中支持細胞形狀不規(guī)則，胞體較大、胞核呈橢圓形、胞質(zhì)呈網(wǎng)狀、核仁區(qū)著色較淡，紫色的細胞核內(nèi)清晰可見染成深紫色的雙極小體；而生精細胞呈圓形或卵圓形，胞核大，胞質(zhì)極少，核占據(jù)絕大部分細胞體積。結(jié)果表明本課題建立的大鼠睪丸生精-支持細胞原代共培養(yǎng)模型與資料和其他文獻是相符的，可以應用于其他研究。本課題應用MTT法檢測大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細胞的細胞活性、Hoechst33258染色法和Annexin V-FITC法檢測了納米鎳對大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細胞的凋亡作用的影響，發(fā)現(xiàn)納米鎳能引起大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細胞存活率的下降，并表現(xiàn)出劑量效應關(guān)系；同時，導致大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細胞凋亡率的顯著性增加，且在高劑量時(400 μg/mL)時，凋亡細胞大量出現(xiàn)，凋亡率達17.8%。lncRNA基因芯片檢測結(jié)果顯示與凋亡相關(guān)的LncRNA共169個，實驗組與對照組相比，上調(diào)的有117個，下調(diào)的有52個。接著建立lncRNA-miRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡，通過生物信息學對lncRNA共表達的miRNA和mRNA進行分析，從而明確lncRNA對關(guān)鍵信號通路的調(diào)控作用不僅可深入探討環(huán)境污染物毒性作用的調(diào)控機制，更重要的是為疾病的預防、診斷和治療提供可能的有潛力的生物標志和治療靶標。

在本課題組前期的研究當中，體內(nèi)研究表明[9]納米鎳對雄性SD大鼠有生殖毒性，可損傷大鼠睪丸結(jié)構(gòu)和精子運動功能。納米鎳誘導秀麗線蟲生殖毒性的結(jié)果表明，與微米鎳相比較，納米鎳具有更高的生殖毒性，包括育雛數(shù)量減少，受精卵和精子激素活化，世代時間和不成熟的精子細胞增加[10]。 Gallo等[15]研究了納米鎳暴露對海洋無脊椎動物(海鞘類)精子質(zhì)量的影響。研究結(jié)果提示，納米鎳誘導氧化應激導致脂質(zhì)過氧化和DNA片段化并改變線粒體膜電位和精子形態(tài)。研究顯示[1-5]，納米鎳能改變細胞周期、升高ROS水平、損傷DNA和改變某些細胞因子，最終導致一系列毒性。我們前期研究還顯示納米鎳可通過誘導生殖細胞凋亡產(chǎn)生生殖損害，并且Caspase通路在其中發(fā)揮著重要作用[12]。本次研究表明納米鎳可以導致大鼠睪丸生精-支持共培養(yǎng)細胞凋亡，凋亡可能是納米鎳引起細胞毒性的關(guān)鍵機制，lncRNA和生殖發(fā)育及細胞凋亡關(guān)系密切，但lncRNA在環(huán)境污染物所致生殖損傷中的作用及其機制研究報道極少。因此，本研究在基因芯片的檢測基礎(chǔ)上進一步構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡，本課題組將結(jié)合生物信息學分析進一步篩選凋亡相關(guān)lncRNA，后期準備深入研究納米鎳引起的生殖細胞凋亡過程中的分子機制及l(fā)ncRNA在其中的調(diào)控作用，不僅可以明確納米材料生殖毒性的分子機制，更重要的是為生殖損傷的預防和治療提供生物標志和治療靶標，對保護生殖健康以及制定納米鎳安全性評價標準有著極其重要的科學和實際意義。

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