■張皓然 劉金松 張玲玲 楊彩梅，*

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院，浙江臨安 311300；2.浙江萬方生物科技有限公司，浙江安吉 313307）

抗生素在畜牧業(yè)中的濫用問題對動物的免疫功能和食品安全都造成了威脅。因此尋找和開發(fā)新型的、更為安全的能代替抗生素的飼料添加劑成為動物營養(yǎng)研究的熱點。

植物精油以其天然、安全、高效等優(yōu)點成為抗生素的替代品，植物精油具有促進動物采食、提高其生長性能、增強抗氧化和機體免疫力等功能[1]。有機酸主要是針對斷奶仔豬的胃酸分泌不足而開發(fā)的一種飼料添加劑，但現(xiàn)在經(jīng)過逐步的研究，發(fā)現(xiàn)其具有促生長和抑制害菌的作用。研究表明有機酸可降低飼料pH值，抑制霉菌和病原菌生長[2-3]，改善畜禽的生產(chǎn)性能，提高飼料利用率，增強動物機體免疫力[4-5]。目前對植物精油和有機酸均有一定的研究，但對于植物精油的配伍及其與有機酸復(fù)合的抑菌作用研究較少。本試驗通過研究不同植物精油及植物精油與有機酸復(fù)配，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌效果，從而為植物精油與有機酸在動物生產(chǎn)中的合理應(yīng)用進一步提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物精油（肉桂醛、百里香酚、香蘭素）、有機酸（山梨酸、苯甲酸、檸檬酸）均由浙江萬方生物科技有限公司提供，并于陰涼避光處保存。植物精油濃度為10 mg/ml，有機酸濃度為 5、10、50 mg/ml。大腸桿菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）購自中國菌種保藏中心。

1.2 試驗設(shè)計

牛津杯法測定抑菌圈直徑。以無菌操作在培養(yǎng)基表面垂直放4個已滅菌的牛津杯，依次加入樣品（植物精油與有機酸或丁酸類物質(zhì)分別按照1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的比例復(fù)合）。加滿后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱24 h。每組做3個平行。牛津杯試驗結(jié)果的判定標準：抑菌圈直徑＞20 mm為非常敏感，15～20 mm之間為高度敏感，10～15 mm為中度敏感，＜10 mm為低度敏感。抑菌圈直徑與抗菌活性成正比。

1.3 最小抑菌濃度（MIC）的測定方法

采用試管二倍稀釋法測定植物精油和有機酸對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件One Way ANOVA進行統(tǒng)計分析，并進行Duncan's法多重比較，結(jié)果以“平均值±標準誤”表示。

2 結(jié)果分析

2.1 植物精油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的抑菌效果（見表1、圖1）

表1 百里香酚、肉桂醛、香蘭素的抑菌直徑比較

圖1 百里香酚、肉桂醛、香蘭素的抑菌效果

表1與圖1的結(jié)果表明：植物精油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌都有抑制作用，其中肉桂醛對三種菌的抑菌效果均為非常敏感。百里香酚對金黃色葡萄球菌與沙門氏菌的抑菌效果也為非常敏感。

表2的結(jié)果表明：肉桂醛和百里香酚對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC值相同，均明顯低于香蘭素，對沙門氏菌肉桂醛的MIC值最低，表明抑菌作用最強，百里香酚對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果好于對沙門氏菌的抑菌效果。香蘭素的MIC值較高，表明抑菌效果較差，MIC的結(jié)果與抑菌圈結(jié)果基本一致。

表2 百里香酚、肉桂醛、香蘭素的最小抑菌濃度比較

2.2 復(fù)合植物精油的抑菌效果(見表3)

由表3可知，百里香酚和肉桂醛的復(fù)合比例達到1∶2和1∶3時對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌能力均達到非常敏感，百里香酚和肉桂醛的復(fù)合比例為2∶1時對大腸桿菌的抑菌效果最好。但百里香酚和肉桂醛復(fù)合的抑菌效果與單獨使用肉桂醛相比有一定差異（見表1、表3），但兩者復(fù)合可以降低肉桂醛的用量。百里香酚與肉桂醛以1∶3的比例復(fù)合時抑菌效果最強。

2.3 有機酸的抑菌效果（見表4、圖2、表5）

由表4與圖2可知，苯甲酸、山梨酸與檸檬酸對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌均有抑菌效果，其中檸檬酸在50 mg/ml的濃度下的抑菌效果最好，均達到非常敏感水平。有機酸的抑菌能力與其濃度相

關(guān)，濃度越大，抑菌效果越強。由表5可知，檸檬酸的MIC值最大，結(jié)合表4的結(jié)果，表明檸檬酸在高濃度下有突出的抑菌能力，但在低濃度下的抑菌能力較弱。山梨酸和苯甲酸在較低的濃度下就能產(chǎn)生抑菌作用，但在高濃度時抑菌能力弱于檸檬酸。

表3 百里香酚與肉桂醛復(fù)合的抑菌效果

表4 不同濃度山梨酸、檸檬酸、苯甲酸的抑菌效果

圖2 不同濃度山梨酸、檸檬酸、苯甲酸的抑菌效果圖

表5 山梨酸、檸檬酸、苯甲酸最小抑菌濃度比較

2.4 復(fù)合植物精油與酸化劑(檸檬酸)復(fù)合抑菌效果(見表6、圖3)

表6 復(fù)合植物精油（百里香酚∶肉桂醛=1∶3）與檸檬酸復(fù)合后抑菌圈直徑

圖3 復(fù)合植物精油與檸檬酸不同比例復(fù)合的抑菌效果圖

由表6和圖3可知，植物精油與檸檬酸以不同比例復(fù)合均可明顯提高對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果，表明兩者有協(xié)同作用，但是對沙門氏菌的抑菌效果無顯著影響。

3 討論

研究表明在植物精油中，百里香酚和肉桂醛屬于抑菌活性最強的成分，二者均能作用于細菌細胞膜上的靶點。百里香酚的疏水性成分能夠直接作用于細菌細胞膜上的雙分子脂膜，使細菌細胞膜的構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致細胞內(nèi)容物外泄。百里香酚可以改變大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的細胞膜上的脂肪酸的結(jié)構(gòu)和比例，降低膜不飽和脂肪酸的含量，增加飽和脂肪酸的含量，從而降低了細胞膜的流動性，破壞細菌細胞的形態(tài)。肉桂醛的作用部位不僅僅是細胞膜，它能穿透細胞膜進入細胞質(zhì)，通過影響細菌細胞中的結(jié)構(gòu)保守的蛋白質(zhì)，阻止細胞分裂，從而抑制了細菌的活性。王改琴等（2014）采用瓊脂平板孔洞法分別對不同來源的肉桂醛、香芹酚等植物精油及其混合物進行體外抑菌效果篩選和評估，結(jié)果表明肉桂醛的抑菌效果最好，肉桂醛、香芹酚、丁香酚、百里香酚4種精油組成的復(fù)方產(chǎn)品對大腸桿菌等腸道有害菌有較好的抑制作用，且熱穩(wěn)定性好[6]。李文茹等（2013）研究了肉桂、山蒼子、丁香、香茅、迷迭香和大蒜精油等6種典型植物精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性。結(jié)果表明肉桂的抑菌效果最好[7]。吳克剛等通過測定抑菌圈直徑、最低抑菌濃度和最小殺菌濃度，研究8種植物精油對腸道致病菌和益生菌的體外抑菌活性并與5種抗生素比較，結(jié)果表明：綜合抑菌效果最好的是肉桂和牛至，其對黃曲霉抗菌效果優(yōu)于抗生素[8]。Macheboeuf等（2008）結(jié)果表明，肉桂醛是醛類揮發(fā)油中抑菌效果最好的活性物質(zhì)[9]。賈聰慧的研究表明，當肉桂醛和百里香酚濃度比為6∶1時，復(fù)合精油具有最強的抑制大腸桿菌、沙門氏菌和普通變形桿菌生長的作用[10]。本試驗的中植物精油的抑菌作用結(jié)果與其它研究結(jié)果基本一致，表明肉桂醛具有最強的抑菌活性，本試驗的結(jié)果還表明：百里香酚和肉桂醛的復(fù)合比例達到1∶3時對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌能力具有協(xié)同作用。

有機酸作為小分子可以穿過細菌外膜的孔道進入細胞質(zhì)，作用于磷酸和脂多糖，從而破壞外膜的完整性，使細菌細胞的內(nèi)容物外泄，達到了抑菌的效果。王麗娜等（2015）研究表明，檸檬酸表現(xiàn)出對沙門菌屬較強的抑菌效應(yīng)，并對抑制細菌增殖呈現(xiàn)劑量依賴性[11]。裴瑞松等（2007）研究表明，肉桂醛與檸檬酸對抑菌有協(xié)同作用，且通過復(fù)配可降低肉桂醛的MIC[12]。Paulus等（2016）的體外抑菌實驗結(jié)果表明，山梨酸、苯甲酸和檸檬酸在較低濃度時對抑掉沙門氏菌生長是有效的，其中苯甲酸的效果最好[13]。而Friedman等（2008）研究了70多種苯甲醛和苯甲酸對大腸桿菌O157：H7、腸沙門氏菌、空腸彎曲菌和單核李斯特菌的殺菌活性，結(jié)果表明，不同種類的苯甲酸的抑菌效果是不同的[14]。Cerisuelo等的研究結(jié)果表明，將低劑量的植物精油與丁酸鈉混合，對沙門氏菌的抑制有很好的效果[15]。本試驗結(jié)果表明，植物精油復(fù)合物與檸檬酸復(fù)合的抑菌效果優(yōu)于植物精油抑菌效果，但并沒有表現(xiàn)出比檸檬酸的單獨使用更強的抑菌效果，可能因為本試驗使用的檸檬酸濃度較高，對3種菌的抑制作用已達到非常敏感水平，所以協(xié)同作用不明顯，低濃度的檸檬酸與植物精油的協(xié)同作用還有待于進一步研究。