■張立蘭 鐘儒清 陳 亮 張宏福

（中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193）

自1996年出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化種植以來，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積持續(xù)了21年的高速增長，截至2017年種植面積已達到1.898億hm2[1]。玉米作為種植面積全球第二的轉(zhuǎn)基因作物，85%的玉米應用于畜禽飼料[2]。同時，畜禽飼用具有大劑量性、長期多代性等特點。因此，開展轉(zhuǎn)基因玉米的飼用安全性評價具有重要意義。

轉(zhuǎn)基因作物安全性評價的核心是研究轉(zhuǎn)基因外源成分的消解和轉(zhuǎn)移規(guī)律。腸道作為機體抵御外界環(huán)境、細菌和食物抗原的第一道防線，以及機體最大的免疫器官，與機體的營養(yǎng)代謝、機體免疫等有著重要的關系[2-4]。因此，轉(zhuǎn)基因作物對畜禽腸道健康的影響是轉(zhuǎn)基因作物飼用安全性評價的重點。譚建莊[5]研究表明，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因豆粕對1～21 d肉仔雞的各項腸黏膜免疫指標均沒有影響。孫鍇[6]研究表明，含有Cry1Ac和Bar基因的雙抗水稻對肉雞小腸的相對重量和長度等發(fā)育指標以及小腸絨毛高度與寬度、隱窩深度和腸壁厚度等指標均沒有顯著影響。Trabalza-Marinucci等[7]在光鏡下觀察到轉(zhuǎn)基因玉米（Bt176）組母羊與羔羊的十二指腸、盲腸闌尾、瘤胃和皺胃的組織形態(tài)與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M相比沒有顯著差異。本實驗室前期研究了轉(zhuǎn)Cry1Ac基因玉米對純系白來航母雞腸道組織形態(tài)的影響，結(jié)果表明，試驗組與對照組小腸各段絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度/隱窩深度等指標沒有顯著差異[8]。目前已報道的開展轉(zhuǎn)maroACC基因玉米長期、跨代飼用安全性評價的研究很少，因此本研究以轉(zhuǎn)maroACC基因玉米（CC）為試驗材料，同源非轉(zhuǎn)基因玉米（CT）作為對照，在實驗室前期研究的基礎上，由親代蛋雞繁育子代蛋雞，繼續(xù)飼喂與親代蛋雞相同的試驗飼糧，研究跨代飼喂轉(zhuǎn)maroACC基因玉米對子代母雞和公雞腸道發(fā)育和組織形態(tài)等指標的影響，為轉(zhuǎn)maroACC基因玉米蛋雞的飼用安全性評價提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)maroACC基因玉米（CC）和同源非轉(zhuǎn)基因玉米（CT）均來源于同一親本（中國農(nóng)業(yè)大學），且種植、收割、運輸、加工等各個過程的條件完全相同，為了避免交叉污染，轉(zhuǎn)基因玉米與同源非轉(zhuǎn)基因玉米在整個過程要保證嚴格分開。非轉(zhuǎn)基因豆粕來自九三糧油工業(yè)集團（中國，哈爾濱）。

1.2 試驗動物與飼養(yǎng)管理

試驗選用48只健康純系白來航產(chǎn)蛋母雞（50周齡）隨機分為2種飼糧處理（8個重復/處理，3只雞/重復），即：同源非轉(zhuǎn)基因玉米飼糧（CT）和轉(zhuǎn)maroACC基因玉米飼糧（CC）。試驗采用三層立體籠養(yǎng)，采用自然光照+人工補光保持16 h光照，光照強度為20 lx，溫度(22±3)℃，濕度50%～55%，自由采食和飲水，合理通風。每天上午8：00和下午4：00各添料1次，下午3：00撿蛋一次。按照正規(guī)程序進行免疫，每周至少帶雞消毒1次。連續(xù)飼喂12周后，通過人工授精、孵化得到子代蛋雞。

子代蛋雞根據(jù)親代母雞的分組分為2個飼糧處理組：①CT玉米喂母雞/CT玉米喂子代雞（CT-CT）、②CC玉米喂母雞/CC玉米喂子代雞（CC-CC）。子代蛋雞0～8周混合飼養(yǎng)，第8周開始公母分開飼養(yǎng)。子代公雞（6個重復/處理，6只雞/重復）飼喂32周，母雞（8個重復/處理，3只雞/重復）飼喂36周。試驗結(jié)束后，每個重復隨機選擇一只蛋雞（6只公雞/處理和8只母雞/處理）分別屠宰取樣。根據(jù)蛋雞生產(chǎn)管理規(guī)程對孵化、育雛等過程中的溫度、濕度、飼養(yǎng)密度等進行控制[9]。雛雞舍第1～3 d 35～33 ℃，3～7 d 33～32 ℃，以后每周降低3℃，直到第6周降到22～23℃；第1～10 d濕度為70%，前6周65%～60%，以后保持在50%～55%。第1周光照為23 h，第2～17周逐漸減少到自然光照，第18周開始每周增加0.5～1 h，直到達到產(chǎn)蛋需要光照（16 h）。自由飲水，合理通風，按照正規(guī)程序進行消毒和免疫。

1.3 試驗飼糧

根據(jù)我國蛋雞飼養(yǎng)標準（NY/T 33—2004）和NRC（1994）蛋雞營養(yǎng)需要以及白來航蛋雞飼養(yǎng)手冊配制玉米-豆粕型基礎飼糧。利用PCR方法和ELISA方法對玉米原料和試驗飼糧檢測轉(zhuǎn)基因片段，結(jié)果CC玉米原料及飼糧中檢測到了maroACC基因和maroACC蛋白，CT玉米原料和飼糧中沒有檢測到maroACC基因和maroACC蛋白[10]。玉米原料和試驗飼糧的組成及營養(yǎng)水平見表1和表2。

表1 玉米原料化學成分和氨基酸含量分析（DM基礎）

1.4 樣品采集和指標測定

1.4.1 腸道長度

在試驗第32周末，每個重復隨機選擇1只公雞，每個處理共6只公雞；在試驗第36周末，每個重復隨機選擇1只母雞，每個處理共8只母雞，稱重、頸部放血處死后，分離腸道，并測定腸道長度，分別計算小腸（十二指腸、空腸、回腸）和大腸（盲腸、直腸）各段的體重校正長度。

各段腸道體重校正長度（cm/kg）=各段腸道長度/活體重[14]。

1.4.2 小腸組織形態(tài)

腸道長度測定結(jié)束后，用生理鹽水將十二指腸、空腸、回腸內(nèi)容物沖洗干凈，選取每個腸段中間部位1 cm左右放于4%的多聚甲醛溶液中固定，室溫保存。固定的小腸組織標本，經(jīng)水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋處理后，制成切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色后用光學顯微鏡觀察，測量各腸段的絨毛高度和隱窩深度并計算二者的比值。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2016進行初步整理，使用JMP 10.0軟件進行T-test檢驗，結(jié)果用“平均值±標準差”表示，以P＜0.05和P＜0.01分別作為差異顯著和極顯著性的判別標準，0.05＜P＜0.1作趨勢分析。

2 結(jié)果

2.1 子代蛋雞腸道長度測定結(jié)果

轉(zhuǎn)maroACC基因玉米和同源非轉(zhuǎn)基因玉米對子代蛋雞腸道長度影響的結(jié)果如表3所示。與CT-CT組相比，CC-CC組對子代公雞小腸總長、大腸總長以及腸道總長的絕對長度和體重校正長度均沒有顯著影響。與CT-CT組相比，子代母雞小腸總長、大腸總長以及腸道總長的絕對長度和體重校正長度也沒有顯著差異。

2.2 子代蛋雞腸道組織形態(tài)測定結(jié)果

與CT-CT組相比，CC-CC組對子代母雞小腸各段的絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度/隱窩深度等指標均沒有顯著影響（表4）；CC-CC組對子代公雞小腸各段絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度均沒有顯著影響（表5）。

由圖1可知，CT-CT組和CC-CC組子代公雞和母雞小腸各段黏膜層次分明，結(jié)構(gòu)完整。小腸隱窩排列緊密整齊，無可見的病理學變化。

3 討論

3.1 玉米原料和飼糧營養(yǎng)成分含量分析

實質(zhì)等同性原則是轉(zhuǎn)基因作物飼用安全性評價的重要原則[15]，轉(zhuǎn)基因玉米營養(yǎng)成分含量分析是轉(zhuǎn)基因玉米飼用安全性評價的第一步，也是決定轉(zhuǎn)基因玉米是否可以開展飼用安全性評價的決定因素。本試驗中用于配制親代蛋雞和子代蛋雞（母雞和公雞）飼糧的轉(zhuǎn)maroACC基因玉米與同源非轉(zhuǎn)基因玉米常規(guī)概略養(yǎng)分以及氨基酸含量具有相似性，與文獻報道的結(jié)果相符合[13，16]，而且養(yǎng)分含量的范圍也在正常范圍之內(nèi)[11-13]。鐘儒清等[17]利用仿生消化方法體外測定了本試驗中的轉(zhuǎn)maroACC基因玉米（CC）和同源非轉(zhuǎn)基因玉米（CT）原料以及飼糧的體外干物質(zhì)消化率、體外能量消化率和體外消化能，結(jié)果CC組與CT組相比，玉米原料和飼糧體外全消化道的干物質(zhì)消化率、能量消化率和消化能均沒有顯著差異。該結(jié)果為本試驗中轉(zhuǎn)maroACC基因玉米和同源非轉(zhuǎn)基因玉米作為開展飼用安全性評價材料的可行性提供了依據(jù)。

表2 飼糧組成及營養(yǎng)水平

表2 （續(xù)） 飼糧組成及營養(yǎng)水平

表3 轉(zhuǎn)基因玉米對子代蛋雞腸道長度的影響

表4 轉(zhuǎn)基因玉米對子代母雞腸道組織形態(tài)的影響

表5 轉(zhuǎn)基因玉米對子代公雞腸道組織形態(tài)的影響

3.2 轉(zhuǎn)基因玉米對子代蛋雞腸道長度和組織形態(tài)的影響

腸道是動物消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所，腸道健康對于維持動物正常的生長發(fā)育、提高生產(chǎn)性能具有重要意義，畜禽腸道發(fā)揮消化吸收、黏膜免疫等功能依賴于腸道結(jié)構(gòu)和功能的完整性。腸道絨毛高度和絨毛面積增加，小腸與營養(yǎng)物質(zhì)的接觸面積會增加，從而對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力增強。隱窩深度增加，表明組織周轉(zhuǎn)代謝增加，對營養(yǎng)物質(zhì)的需求增加，動物利用養(yǎng)分的效率會下降，從而導致生產(chǎn)性能下降。絨毛高度/隱窩深度可以綜合反映小腸的功能狀態(tài)，比值增大表明腸道發(fā)育改善，比值下降則表明腸道消化吸收能力下降。杯狀細胞的功能有：①分泌黏液；②攝取葡萄糖和氨基酸；③護送食物到樹突細胞（一種免疫細胞），與治療炎性腸道疾病、食物過敏等相關。杯狀細胞數(shù)量的增加對于增強腸道黏膜免疫系統(tǒng)的抵抗作用具有重要作用[18]。

圖1 子代蛋雞腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)（HE染色，40×）

高春起[19]研究表明，轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米對海蘭褐蛋雞十二指腸、空腸和回腸的相對重量、相對長度、絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度/隱窩深度均沒有顯著影響。周暉[20]研究表明，轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米對肉仔雞小腸各段的長度指數(shù)、重量指數(shù)和小腸總重量指數(shù)均無顯著影響，十二指腸的絨毛高度和隱窩深度也沒有顯著影響，而且腸道組織形態(tài)也沒有可見的病理變化。徐以娟[21]研究表明，飼喂含轉(zhuǎn)基因植酸酶玉米組和非轉(zhuǎn)基因玉米組的杜長大三元雜交斷奶仔豬小腸各段（十二指腸、空腸和回腸）的長度指數(shù)、重量指數(shù)以及小腸總重量指數(shù)均未出現(xiàn)顯著差異，十二指腸的絨毛高度、隱窩深度和黏膜厚度等指標兩組之間也沒有顯著差異，表明飼喂轉(zhuǎn)基因玉米對斷奶仔豬的小腸發(fā)育未產(chǎn)生明顯的不良影響。Walsh等[22]研究顯示，轉(zhuǎn)Bt基因玉米除了降低斷奶仔豬十二指腸每微米絨毛杯狀細胞數(shù)量外，對腸道絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度/隱窩深度等指標均沒有影響。本試驗中CC-CC組對子代母雞和公雞小腸、大腸及腸道總長的絕對長度和體重校正長度、小腸各段絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度/隱窩深度等指標均沒有顯著影響，研究結(jié)果與前人研究結(jié)論一致。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，與同源非轉(zhuǎn)基因玉米處理組相比，跨代飼喂轉(zhuǎn)maroACC基因玉米對子代母雞和公雞腸道絕對長度和體重校正長度、小腸各段組織形態(tài)等指標均沒有顯著影響；子代母雞和公雞小腸各段組織形態(tài)未發(fā)現(xiàn)可見的病理變化。