維生素D3（Vitamin D3, VD3）的經(jīng)典生物學(xué)作用是調(diào)節(jié)鈣磷平衡，維持骨骼健康[1]。VD3中毒常因使用不當(dāng)，或在治療佝僂病過程中反復(fù)大量使用VD3所致[2]。腎臟是 VD3代謝的重要器官，有學(xué)者指出VD3是預(yù)測多種慢性腎臟疾病進(jìn)展的獨(dú)立危險因素[3]。腎損傷是不可逆轉(zhuǎn)的，組織病理切片和超微結(jié)構(gòu)變化是揭示機(jī)體病理變化機(jī)制的重要手段之一，長期使用小劑量VD3時對腎小球組織結(jié)構(gòu)的影響以增生為主[4]。中毒劑量 VD3造成腎損傷的研究報道較少。本研究通過觀察腎組織病理切片和超微結(jié)構(gòu)變化，探討VD3對腎臟產(chǎn)生毒性的劑量，及不同劑量VD3對大鼠腎組織結(jié)構(gòu)的影響程度，為研究VD3造成腎毒性的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康 SD大鼠，雄雌各半，體重150～170 g，SPF級，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（冀）2008-1-003。飼養(yǎng)于山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院藥理研究室屏障動物房，實驗動物使用許可證號：SCXK（晉）2010-0005，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后使用。

1.1.2 藥品與試劑 VD3注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號：20170106，規(guī)格：7.5 mg:1 ml/支）；甲醛（上海滬試實驗室器材股份有限公司，批號：20160523）；無水乙醇（優(yōu)級純GR）；0.9%氯化鈉注射液（山東華魯制藥有限公司，批號：20170815）。另使用電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，型號：BT2202S）、病理切片機(jī)（德國徠卡，批號：TS6016+CV6030型）、光學(xué)顯微鏡Olympas HB-2。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 將40只健康SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組（0 IU/kg）、VD3小劑量組（1875 IU/kg）、VD3中劑量組（3750 IU/kg）、VD3大劑量組（7500 IU/kg）、VD3超大劑量組（15 000 IU/kg），每組8只。

1.2.2 VD3配制 采用玉米油對維生素D3注射液進(jìn)行等量遞增稀釋，分別配成所需濃度應(yīng)用，每天在實驗前新鮮配制。

1.2.3 給藥方式、劑量和療程 采用常規(guī)灌胃方式給藥，給藥體積為0.5 ml/100 g，每天1次，連續(xù)3周。

1.3 觀察腎組織變化

1.3.1 大鼠腎組織病理學(xué)變化 采血后放血處死大鼠，剪開腹腔并取腎組織塊于10%甲醛內(nèi)固定，24 h后換液，48 h后取材做石蠟包埋，做成4 μm厚切片，HE染色行光鏡檢查，觀察腎小球、腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)并拍照記錄。

1.3.2 大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)變化 取出單側(cè)腎置于培養(yǎng)皿中，滴入4%戊二醛磷酸緩沖液（pH7.2～7.4）充分浸潤，用雙面刀片將腎皮質(zhì)部位組織修成小塊（1 mm3大小）；吸取樣本放入加有4%戊二醛磷酸緩沖液（pH 7.3）小瓶內(nèi)固定，標(biāo)記后放入4℃冰箱中保存。標(biāo)本固定24 h后采用0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗后，于4℃冰箱內(nèi)梯度乙醇脫水，50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇各15 min，再至90%乙醇和90%丙酮混合液脫水15 min，90%丙酮脫水15 min，再在100%丙酮室溫下脫水15 min，重復(fù)3次。采用環(huán)氧樹脂618包埋，做1 μm厚半薄切片，行甲苯胺藍(lán)染色，光學(xué)顯微鏡下定位，LKB-l型超薄切片機(jī)（瑞典Leica）切片，切片厚度為50 am，采用枸櫞酸鉛和醋酸雙氧鈾染色。日本日立H-7500 透射電子顯微鏡下觀察腎小球基底膜及足細(xì)胞足突形態(tài)學(xué)變化并拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 VD3對各組大鼠腎組織病理學(xué)的影響 HE染色結(jié)果顯示：與空白對照組相比，VD3各劑量組腎小管上皮組織細(xì)胞均發(fā)生了不同程度變化，主要表現(xiàn)為近曲腎小管上皮細(xì)胞腫脹、變性，以大劑量組最明顯。見圖1。

2.2 VD3對大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)的影響 組織學(xué)電鏡超微結(jié)構(gòu)檢測觀察顯示：空白對照組足突、基膜和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、窗孔結(jié)構(gòu)無明顯異常，毛細(xì)血管管腔內(nèi)透明；小劑量組基膜厚薄不均，毛細(xì)血管管腔內(nèi)不透明，布滿顆粒狀物；中劑量組基膜增厚，毛細(xì)血管管腔內(nèi)出現(xiàn)吞飲小泡；大劑量組足突部分融合，基膜增厚改變典型，內(nèi)皮細(xì)胞分界不清；超大劑量組足細(xì)胞的足突和基膜、內(nèi)皮細(xì)胞分界不清，融合在一起，兩側(cè)完整，出現(xiàn)內(nèi)皮吞飲小泡，毛細(xì)血管管腔內(nèi)有兩個大小不等的圓形均質(zhì)體，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰。見圖2。

圖1 腎組織病理學(xué)改變（HE 400X）

圖2 VD3對大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)的影響

3 討論

隨著對 VD3研究的不斷深入，其臨床應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，而 VD3的合理攝入量和安全性等問題需引起臨床高度重視。VD3攝入劑量過大、應(yīng)用時間過長均可導(dǎo)致中毒。VD3在體內(nèi)需經(jīng)過兩次羥化后才能發(fā)揮其生物活性，第一次羥化在肝臟內(nèi)，生成25-OH-D3，然后通過氧化反應(yīng)，最終生成水溶性VD3-23羧酸，隨尿液排出[5]；當(dāng)機(jī)體攝入并蓄積過量VD3時，體內(nèi)VD3自反饋調(diào)節(jié)作用失調(diào)，可導(dǎo)致血鈣升高[6]，進(jìn)而出現(xiàn)一系列繼發(fā)癥狀，臨床上嚴(yán)重的高鈣血癥可能影響腎臟、胃腸道、肌肉骨骼系統(tǒng)、眼睛和皮膚[7]。

目前，我國兒童（0～14歲）血清25-OH-D3水平正常參考值范圍為37.5～250.0 nmoL/L[8]；有研究[9-10]報道，11例患者，每人平均誤食VD3為1308 IU，均出現(xiàn)臨床中毒癥狀，血鈣均增高至3.57～4.43 mmol/L，9例出現(xiàn)急性腎損傷，8例為急性腎功能衰竭。本研究中 VD3小劑量組（1875 IU/kg）、VD3中劑量組（3750 IU/kg）、VD3大劑量組（7500 IU/kg）、VD3超大劑量組（15 000 IU/kg），4組給藥劑量經(jīng)換算均高于臨床正常使用劑量，并大于引起腎損傷的劑量，故給藥后大鼠均可能會出現(xiàn)高鈣血癥。

本研究組織病理學(xué)檢測顯示：VD3各劑量組大鼠腎小管與空白對照組比較均發(fā)生了明顯變化，主要表現(xiàn)為近曲小管上皮細(xì)胞腫脹、變性，管腔變小，出現(xiàn)管型等變化，偶見間質(zhì)增生，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤等，以大劑量組最明顯。提示使用VD3后造成的腎損傷主要以近曲腎小管上皮細(xì)胞損傷為主，以 7500 IU/kg劑量時最明顯。此現(xiàn)象是否與VD3主要是在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為1,25-(OH)2D3有關(guān)，有待進(jìn)一步深入研究確證。

組織學(xué)電鏡超微結(jié)構(gòu)檢測示：空白對照組大鼠腎小球組織結(jié)構(gòu)清晰、完整。VD3各劑量組大鼠用藥3周后腎小球超微結(jié)構(gòu)均發(fā)生了明顯變化，小劑量組基膜厚薄不均，毛細(xì)血管管腔內(nèi)不透明，布滿顆粒狀物；中劑量組基膜增厚，毛細(xì)血管管腔內(nèi)出現(xiàn)吞飲小泡；大劑量組足突部分融合，基膜增厚改變典型，內(nèi)皮細(xì)胞分界不清；超大劑量組足細(xì)胞的足突和基膜、內(nèi)皮細(xì)胞分界不清，融合在一起，兩側(cè)完整，出現(xiàn)內(nèi)皮吞飲小泡，毛細(xì)血管管腔內(nèi)有兩個大小不等的圓形均質(zhì)體，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰。表明中毒劑量VD3可造成腎小球毛細(xì)細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞、基膜、足細(xì)胞這三個主要過濾屏障系統(tǒng)超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，破壞腎小球濾過功能，濾過功能發(fā)生異常，可能是其造成腎臟毒性的另一主要原因。雖然，電鏡顯示各劑量組超微結(jié)構(gòu)特征有一定區(qū)別，但這種區(qū)別不能說明對腎臟的毒性改變呈劑量相關(guān)性，再增大劑量會不會導(dǎo)致更顯著變化，需進(jìn)一步研究。因為藥物效應(yīng)的強(qiáng)弱與其劑量大小并非簡單的線性相關(guān)關(guān)系，劑量-反應(yīng)關(guān)系可表現(xiàn)為S形曲線，直線、雙曲線等。結(jié)合組織病理學(xué)檢查結(jié)果推斷，VD3對腎臟的毒性可以引起腎小管和腎小球功能損傷。

綜上所述，7500 IU/kg中毒劑量VD3可造成實驗大鼠明顯毒性反應(yīng)，是建立實驗大鼠中毒模型的推薦劑量。