(濟寧醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院，日照 276826)

骨明膠是一種高分子量的聚合物，主要從部分水解的骨頭膠原物質(zhì)中提取獲得[1-2]，廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥行業(yè)，可用于心臟瓣膜、角膜、肌腱等軟組織的替代物[3-4]。目前骨明膠的制備工藝主要有傳統(tǒng)的浸灰工藝和現(xiàn)代生物酶法工藝。傳統(tǒng)的浸灰工藝因存在好膠率低、能耗大、耗水量大等缺點，逐漸被淘汰[5]。與傳統(tǒng)浸灰工藝相比，生物酶法工藝因具有明膠質(zhì)量高、生產(chǎn)周期短(2～3d)、噸明膠耗水量低等優(yōu)勢，備受青睞[6]。

影響生物酶法制備骨明膠的關(guān)鍵因素為生物酶的種類，已報道的生物酶法工藝中多采用內(nèi)切型蛋白酶[7-8]。但該酶作用于骨素(骨粉浸酸脫除礦物質(zhì)后的物質(zhì))時，酶解速度過快，酶解終點不易判定，導(dǎo)致所獲骨明膠黏度較低[9]。

本文擬采用以外切型蛋白酶為主的復(fù)合型蛋白酶對骨粉進行酶解，并對骨明膠制備過程中的浸酸終點pH、復(fù)合酶蛋白酶配方、酶解時間進行優(yōu)化，確定優(yōu)質(zhì)骨明膠的制備方法，以期解決生物酶法制備骨明膠過程中存在的缺陷和不足，實現(xiàn)高檔醫(yī)用骨明膠的清潔生產(chǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1原料與試劑 30～150目骨粉購于漯河市五龍明膠有限公司；外切型蛋白酶(風(fēng)味蛋白酶，2萬U/g)購于諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；內(nèi)切型蛋白酶(2709蛋白酶，2萬U/g)購于無錫杰仁生物科技有限公司。

1.1.2儀器 攪拌器(上海析域儀器設(shè)備有限公司)；明膠凍力測試儀(天津創(chuàng)興電子設(shè)備制造有限公司)；明膠勃式黏度測試儀(天津創(chuàng)興電子設(shè)備制造有限公司)；明膠透明度測試儀(天津創(chuàng)興電子設(shè)備制造有限公司)；LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津公司)；TSK-GEL G2000 SWXL色譜柱(300mm×7.8mm，5μm)(上海東曹生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1骨粉浸酸終點pH優(yōu)化 骨粉與水按質(zhì)量比1∶5混合，攪拌至懸浮狀態(tài)，將質(zhì)量分數(shù)為15%的鹽酸以緩慢滴加的方式加入骨粉懸濁液中。第1次浸酸，pH控制在3.5～4.0，浸酸后清洗；第2次浸酸，pH控制在3.0～3.5，浸酸后清洗；第3浸酸pH(浸酸終點)分別控制在pH 0.5(3% HCl)、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0，測定Ca2+殘留率和明膠黏度，優(yōu)化浸酸終點pH控制。整個梯段滴濾浸酸過程中，水溫控制為20 ℃。對照組亦為3次浸酸，每次按骨粉與3%鹽酸質(zhì)量比1∶5混合，攪拌作用2 h后清洗，再進行下一次浸酸。

1.2.2復(fù)合蛋白酶配方優(yōu)化 將骨素(浸酸脫礦后的骨粉)按照質(zhì)量比1∶2 加水，調(diào)節(jié)pH 10.0，分別加入0.2%的不同組分的復(fù)合蛋白酶(風(fēng)味蛋白酶、2709蛋白酶質(zhì)量比分別為9∶1、8∶2、7∶3)，于22 ℃酶解22 h，后調(diào)節(jié)pH 2.0，維持3h完成滅酶。清洗后按照質(zhì)量比1∶2加水，70 ℃水浴提膠3 h，測定所獲骨明膠的黏度、凍力、提交率。

1.2.3酶解時間優(yōu)化 將浸酸脫礦后的骨粉按照質(zhì)量比1∶2加水，調(diào)節(jié)pH 10.0，添加0.2%優(yōu)化后的最佳復(fù)合蛋白酶，于22 ℃分別酶解16、18、20、22、14、30、36 h，后調(diào)節(jié)pH 2.0，維持3h完成滅酶。清洗后按照質(zhì)量比1∶2 加水，70 ℃水浴提膠3 h，測定所獲骨明膠的黏度、凍力、提交率。

1.2.4明膠的絮凝澄清 在連續(xù)攪拌將的條件下，將0.1%陽離子聚丙烯酰胺溶液加入至(65±1)℃的明膠溶液中，直至明膠溶液清澈。

1.2.5干明膠的制備 將明膠溶液置于4 ℃冰箱，待其凝固成型后，切成細條狀，于-20 ℃冷凍過夜，后將其浸沒于95 %乙醇溶液中，30 min后取出擰干，轉(zhuǎn)移至30 ℃烘箱內(nèi)干燥5～6 h，得到水分小于14 %的干明膠。

m1為干明膠質(zhì)量；m2為骨粉的總質(zhì)量。

1.2.6分析方法 1)明膠相對分子質(zhì)量測定。色譜柱TSK-GEL G2000 SWXL(300 mm×7.8 mm，5 μm)；流動相為乙腈、水和三氟乙酸(15∶85∶0.1，V/V)；流速0.6 ml/min；柱溫30 ℃；進樣體積20 μl；檢測波長220 nm。2)明膠凍力、勃式黏度、透明度測定參照醫(yī)用明膠輕工部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(QB2354-2005)。3)酶解中氨基酸測定[10]。4)Ca2+殘余率的測定。分別稱取一定質(zhì)量的骨粉和完成梯度滴濾浸酸的骨粉，清洗數(shù)次，按照重量1∶5加入10%濃鹽酸，浸泡24 h，按GB/T 7476-1987鈣離子EDTA滴定法測定溶液中Ca2+的濃度，并計算Ca2+的殘余率。

m1為完成浸酸后骨粉含有的Ca2+的質(zhì)量；m2為浸酸前骨粉含有的Ca2+的質(zhì)量。

2 結(jié)果和討論

2.1 梯度滴濾浸酸終點pH對骨粉脫礦效果以及明膠黏度的影響

采用骨粉替代2～5cm骨粒，結(jié)合梯度滴濾浸酸的工藝，探討較高pH環(huán)境下是否可以完成骨粉的浸酸脫礦物質(zhì)(Ca2+)，以期減少低pH條件下對骨粉中膠原分子的破壞，提高明膠黏度。

對照組中骨素Ca2+殘余率為4.94%；梯度滴濾浸酸終點pH<2.0時，骨素中Ca2+殘余率隨浸酸終點pH變化較??；梯度滴濾浸酸終點pH>2.0時，骨素中Ca2+殘余率則大幅增加。對不同pH下浸酸獲得的骨素進行酶解后提膠，浸酸終點pH<2.0時，明膠黏度隨浸酸終點pH的升高而大幅提高；浸酸終點pH>2.0時，明膠黏度隨著浸酸終點pH的升高而差異較小。綜合考慮骨粉脫礦效率及所提明膠黏度差異，選擇梯度滴濾浸酸最佳終點pH2.0。見圖1。

圖1 浸酸終點pH對骨粉脫礦效率及明膠黏度的影響

2.2 不同組分的復(fù)合蛋白酶對明膠質(zhì)量的影響

使用外切型風(fēng)味蛋白酶對骨素進行酶解，測定酶解過程中氨基酸含量和pH值的變化。見圖2。

圖2 酶解過程中pH和氨基酸含量變化過程

隨著酶解的進行，溶液中氨基酸總量不斷增加，當(dāng)氨基酸含量達到最大值時，提膠率達到最高，酶解液中氨基酸的含量可作為判斷酶解程度的重要依據(jù)(圖2)。單純采用風(fēng)味蛋白酶酶解骨素，酶解速度較慢，耗時較長(約70 h)。同時，當(dāng)酶解至30 h時，酶解液中開始滋生微生物，有異味，酶解液 pH隨之急劇下降。而通過增加風(fēng)味蛋白酶的用量并不能有效地縮短酶解時間。見圖3。

圖3 不同組分的復(fù)合蛋白酶對明膠提取質(zhì)量的影響

風(fēng)味蛋白酶中添加少量內(nèi)切型2709蛋白酶構(gòu)成復(fù)合型蛋白酶，于22 ℃酶解骨素22 h。隨著2709蛋白酶添加比例的增加，制備的明膠凍力差別較小，提膠率小幅降低，而明膠黏度顯著降低，風(fēng)味蛋白酶與2709蛋白酶質(zhì)量比為8∶2時所提明膠的綜合質(zhì)量最佳，該條件下所提明膠的凍力和黏度均不低于單獨使用外切型風(fēng)味蛋白酶時的結(jié)果，且酶解時間由原來的70h縮短為22h。見圖3。

2.3 酶解時間對明膠質(zhì)量的影響

測定不同酶解時間下所提明膠的凍力、黏度、提膠率。見表1。

表1 酶解時間對明膠質(zhì)量的影響

酶解20 h時，明膠的凍力、黏度最佳；酶解24 h時，明膠的凍力、黏度降幅均在1%以內(nèi)，差異不大。20 h時的提交率也僅比22 h最高時降低2.5%。酶解時間超過30 h時，明膠的凍力、黏度及提膠率均降低。綜合考慮明膠質(zhì)量及生產(chǎn)成本因素，后續(xù)實驗選擇酶解時間為20 h。

2.4 所提明膠的相對分子質(zhì)量分布

經(jīng)工藝優(yōu)化后，所提明膠的透明度>400mm，對其相對分子質(zhì)量分布進行測定。見表2。

表2 所提明膠的相對分子質(zhì)量分布

實驗結(jié)果顯示，所制備的明膠分子中Alpha組分占32.35%，為主要組分。相對分子質(zhì)量>10萬的組分，占52.57%，而相對分子質(zhì)量<5萬的亞Alpha和小分子短肽組分比例較小，僅占14.76%。由此可知，該法制備明膠的過程中，復(fù)合蛋白酶沒有過度降解骨素，克服了所提明膠相對分子質(zhì)量偏低、黏度不高的缺陷。

3 結(jié)論

外切型蛋白酶從膠原纖維肽鏈外端逐一切除氨基酸，在具備較強的水解膠原纖維之間交聯(lián)鍵能力的同時，對膠原纖維內(nèi)部纖維肽鍵的損傷亦較小，可彌補內(nèi)切型蛋白酶酶解速度過快而導(dǎo)致所提骨明膠黏度低的難題。本文采用骨粉代替骨粒進行梯度滴濾浸酸，能有效地將浸酸終點pH提高至2.0，所提骨明膠的黏度提高了90.4%，避免了低pH對膠原的破壞。組合使用外切型風(fēng)味蛋白酶與內(nèi)切型2709蛋白酶酶解骨素，在可保持明膠高黏度的條件下，有效地將酶解時間縮短為20 h。最佳工藝條件下，所提明膠的凍力337 Bloom·g，黏度6.52 mPa·S，提交率為15.3%，透明度>400 mm，相對分子質(zhì)量>10萬的組分占52.57%，明膠質(zhì)量達到高檔醫(yī)用骨明膠國家標(biāo)準(zhǔn)，為后續(xù)生物酶法制備高檔骨明膠的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。