屈金輝,白雪,官士珍，黃海晶,王毅

（天津市天津醫(yī)院檢驗科，天津 300211）

腓骨肌萎縮癥（Charcot-Marie-Tooth，CMT）是最常見的遺傳性周圍神經(jīng)病，具有高度臨床變異性和遺傳異質(zhì)性。發(fā)病率在人群中為1/2 500[1]。此病可累及運動及感覺神經(jīng)，故臨床常表現(xiàn)為進行性遠端肌無力和肌萎縮、感覺減退，又稱為遺傳性運動感覺性神經(jīng)病（heriditary moter and sensory neuropathy HMSN）[2]。該病在幼兒期及青少年期最容易發(fā)病。肌無力和肌萎縮最先出現(xiàn)在肢體遠端，這與其最先累及長的、粗的神經(jīng)纖維有關(guān)，可出現(xiàn)不同程度足畸形，進而進展累及上肢及四肢近端，影響四肢的運動功能。我院近期收治2例疑似病例，經(jīng)基因檢測并結(jié)合臨床癥狀確診為CMTI型和CMTII型，現(xiàn)就這2例的基因型及臨床特征做一探討。

1 資料與方法

1.1 病例資料 患者I：男性，15歲，因雙側(cè)高弓足畸形5年余，逐漸加重1年余入院?；颊哂谌朐呵?年余發(fā)現(xiàn)雙足高弓足畸形，在我院門診就診，于入院前1年發(fā)現(xiàn)高弓足畸形明顯加重，且出現(xiàn)行走疼痛，再次于我院門診就診，本次入院準備行畸形矯正術(shù)。查體：體溫36.4℃，脈搏88次/min，呼吸23次/min，血壓125/68 mmHg。神志清楚，查體合作。心、肺、骨盆和脊柱陰性，雙足高弓足畸形，仰趾畸形，跖趾關(guān)節(jié)跖側(cè)胼胝形成，雙側(cè)脛前及脛后肌群肌力正常，足趾活動、感覺及血運好，足背動脈搏動可觸及。

患者于入院后完善各項術(shù)前檢查。影像顯示：雙側(cè)高弓足畸形。左右跟骨軸位顯示其跟骨骨質(zhì)形態(tài)完整，骨皮質(zhì)連續(xù)，周圍軟組織內(nèi)未見明顯異常密度影。實驗室檢查：血尿常規(guī)、生化免疫常規(guī)及凝血常規(guī)均未提示異常。肌電圖示：上下肢周圍神經(jīng)源性損害(運動感覺纖維受累，髓鞘損害為重，四肢SSR異常）?；颊叩母赣H及祖父均具有雙側(cè)高弓足畸形，并且均存在脊柱側(cè)彎癥狀?；颊吣赣H未見異常。診斷此患者疑似腓骨肌萎縮癥CMTI型，建議做CMT基因篩查。

患者II：男，24歲，以下肢為重的肢體遠端肌肉萎縮和無力1年，中度感覺障礙。肌電圖檢查可見，神經(jīng)傳導速度輕度減慢，巨大運動單元電位、纖顫電位和正銳波，軸突變性。進行了CMT基因篩查。由于患者未住院進一步診治，未做其他檢查?；颊逫I是否有家族史不清楚。

1.2 基因檢測

1.2.1 標本采集及DNA提取 采集患者及其父母的外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝。使用AxyPrep血基因組試劑盒提取基因組DNA，NanoDrop2000核酸定量分析儀檢測DNA濃度及純度，放置-80℃保存?zhèn)溆?。所有研究對象均簽署知情同意書?/p>

1.2.2 基因檢測方法 采用多重連接探針擴增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA）主要檢測 17號染色體短臂 1區(qū) 2帶（17p12）上的大片段重復變異（包括PMP22基因），熒光信號強度介于0.7到1.33之間認定為正常，重復變異的熒光信號強度高于1.33。本試劑盒中17p12區(qū)域（針對范圍）上的基因有PMP22、TEKT3、COX10、ELAC2，其中 DRC3（別名 LRRRC48）是在17p11.2區(qū)域上，而ELAC2、DRC3均在CMT1區(qū)域范圍外。同時采用二代測序檢測+一代驗證的模式，篩選了與此疾病相關(guān)的基因包括DYNC1H1、MA RS、MFN2、MPZ、KIF1B、LITAF、GJB1 等 基 因變異，基因檢測由北京康旭醫(yī)學檢驗所有限公司完成。

2 結(jié)果

2.1 患者I家系基因檢測 MLPA檢測發(fā)現(xiàn)患者I染色體17p12區(qū)域大片段重復變異（包括PMP22基因），見圖1?；颊逫其父染色體17p12區(qū)域大片段重復變異（包括PMP22基因），見圖2。未發(fā)現(xiàn)患者I其母染色體17p12區(qū)域大片段重復變異（包括PMP22基因），見圖3。

圖1 受檢者I DNA測序結(jié)果

圖2 受檢者I其父DNA測序結(jié)果

圖3 受檢者I其母DNA測序結(jié)果

2.2 患者II基因檢測 MLPA檢測未發(fā)現(xiàn)患者II染色體17p12區(qū)域大片段重復變異（包括PMP22基因），見圖4。通過二代測序檢測及一代測序驗證發(fā)現(xiàn)患者II基因DYNC1H1 c.10198-4C＞A和基因MARS c.238C＞T的雜合核苷酸變異，測序圖見圖5。

圖4 受檢者II DNA測序結(jié)果

圖5 受檢者II DNA變異結(jié)果

3 討論

CMT是一種常見的外周神經(jīng)退行性遺傳病，它的遺傳方式包括常染色體顯性遺傳(Autosomal dominant,AD)、常染色體隱性遺傳(Autosomal recessive,AR)和X連鎖顯性和隱性遺傳 (X-linked dominant/recessive,XD/XR)。根據(jù)運動神經(jīng)傳導速度(Motor nerve conduction velocity,MNCV)和復合肌肉動作電位振幅可將該病分為3種類型：即脫髓鞘型、軸突型和中間型。脫髓鞘型除了神經(jīng)活檢示顯著的髓鞘異常外，患者上、下肢MNCV低于正常值；軸突型神經(jīng)活檢示軸突變性，而MNCV未見異常變化或輕度減慢；中間型神經(jīng)活檢兼有脫髓鞘及軸索變性[3]。另外，根據(jù)遺傳方式和神經(jīng)病變的不同，將CMT分為：脫髓鞘型(也稱CMTI)，起病較早，平均年齡為10歲；軸突型(也稱CMTII)，起病較晚，平均年齡為23.9歲[4]。本例患者I 10歲發(fā)病，運動、感覺傳導速度減慢，髓鞘損害嚴重，符合CMTI型?；颊逫I 23歲發(fā)病，以下肢為重的肢體遠端肌肉萎縮和無力，神經(jīng)傳導速度輕度減慢，纖顫電位和正銳波，軸突變性，符合CMTII型。

人類外周髓鞘蛋白基因22(PMP22)的1.5Mb正向串聯(lián)重復突變導致過量表達使Schwann細胞增殖減少，臨床上表現(xiàn)為CMT1A型。PMP22基因重復突變導致的CMT1A為CMTI最常見的亞型[5]。據(jù)報道，70%以上無血緣關(guān)系的CMT1家系及90%以上的散發(fā)患者多由17p11.2-12區(qū)（包含PMP22基因）的1.5Mb的正向串聯(lián)重復突變所致，針對CMT1A型患者在該區(qū)域的斷裂點設(shè)計特定引物進行擴增，再進行酶切獲得特異性酶切片斷即可診斷為基因重復異常[6-7]。

MLPA技術(shù)主要用于基因的重復和缺失檢測。本研究采用MLPA的探針主要針對17號染色體短臂1區(qū)2帶（17p12）上的PMP22基因變異情況而設(shè)計。采用二代測序+一代測序（Sanger測序）驗證的模式，篩選了與此疾病相關(guān)的包括DYNC1H1、MARS、MFN2、MPZ、KIF1B、LITAF、GJB1 等在內(nèi)的基因突變，涉及疾病包括：腓骨肌萎縮癥、痙攣性截癱、周圍神經(jīng)病變和先天性無痛無汗癥等。涵蓋了CMTI、CMTII、CMTX 和 CMT4型的主要致病基因，分別為 PMP22、KIF1B、GJB1和 GDAP1。測序發(fā)現(xiàn)了患者I及其父親染色體17p12區(qū)域大片段重復變異（包括PMP22基因)，未發(fā)現(xiàn)受檢者母親染色體17p12區(qū)域大片段重復變異，說明患者I致病基因來源于其父親的遺傳，符合常染色體顯性遺傳的特點?；颊逫其他篩選基因未見異常突變。在患者II的基因檢測中未發(fā)現(xiàn)PMP22基因的重復變異，非CMTI型。但發(fā)現(xiàn)了2個基因的堿基替換：基因DYNC1H1 c.10198-4C＞A 和基因 MARS c.238C＞T的雜合核苷酸變異，前者為剪切突變，后者為錯義突變，不屬于多態(tài)性變異，在人群中發(fā)現(xiàn)的頻率極低，均可導致蛋白質(zhì)功能受到影響，前者為CMT2O型的致病基因，后者為CMT2U型的致病基因，均為CMTII型的亞型，均為常染色體顯性遺傳方式，這種遺傳方式的雜合變異可能導致發(fā)病。但患者II是否有家族史不清楚，還需通過其父母基因檢測來驗證?；颊逫I的其他篩選基因亦未見異常突變。

目前CMT尚無有效的治療手段，主要是對癥和支持療法。由于本病病程進展緩慢，及時診斷和治療可延緩疾病的發(fā)展，提高患者的生活質(zhì)量。另外，基因檢測對于患者的確診、遺傳咨詢及優(yōu)生優(yōu)育具有重要的臨床價值，值得推廣應用。