張 瑜，金建軍，田笑笑

河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 洛陽(yáng) 471003

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是我國(guó)常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)生率和死亡率均高居第4位，僅次于肺癌、食管癌和胃癌[1]。大量證據(jù)證實(shí)，炎癥與CRC發(fā)病密切相關(guān)。常見(jiàn)的CRC相關(guān)炎癥因子包括：腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、IL-8、IL-33和IL-1等[2-5]。IL-38作為IL-1家族中的新成員，不僅與炎癥有關(guān)，而且與肺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)[6-7]。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IL-38 mRNA在CRC及癌旁正常組織中的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)IL-38受體IL-36R mRNA的表達(dá)，并探討兩者的相關(guān)性及臨床意義。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本收集收集河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院普通外科CRC手術(shù)切除標(biāo)本62例，男36例，女26例，年齡(55.9±12.7)歲(41～72歲)。高-中分化腺癌38例，低分化腺癌24例。臨床Ⅰ～Ⅱ期43例，Ⅲ～Ⅳ期19例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例。所有診斷均經(jīng)病理報(bào)告確診。手術(shù)切除癌組織同時(shí)取其5 cm以外的癌旁正常組織，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存。

1.2主要儀器及試劑NanoDrop One超微量紫外分光光度計(jì)(賽默飛公司，美國(guó))，ABI 7500熒光定量PCR儀(ABI公司，美國(guó))。TRNzol試劑、反轉(zhuǎn)錄RT-PCR 試劑盒和SYBR Green 熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自天根生化科技有限公司(北京，中國(guó))。

1.3總RNA提取及cDNA合成取凍存組織100 mg，加入TRIzol試劑1 ml，按照試劑操作說(shuō)明書(shū)提取總RNA，超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度。取500 ng總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA于-20 ℃保存。

1.4熒光定量PCR采用SYBR Green染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR以檢測(cè)目的基因IL-38和IL-36R mRNA 在62例CRC和對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá)。參照文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)引物：IL-38：5′-TTATCCTTGTGGGCTCAGTT-3′(上游)，5′-AATCCGTTCCCTTGGCTTTT-3′(下游)；IL-36R：5′-GCTGGAGTGTCCACAGCATA-3′(上游)，5′-GCGATAAGCCCTCCTATCAA-3′(下游)。利用管家基因GAPDH作為內(nèi)參照標(biāo)化IL-38和IL-36R基因的表達(dá)。GAPDH引物：5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′(上游)，5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3′(下游)。引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。反應(yīng)體系20 μl，含SYBR Green (2×) 10 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μl，cDNA模板2.0 μl，無(wú)RNA酶水6 μl。反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，設(shè)置熔解曲線反應(yīng)條件：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。采用2-ΔCt進(jìn)行相對(duì)定量，Ct值為熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，ΔCt=Ct(目的基因)- Ct(管家基因)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果呈非正態(tài)分布，數(shù)據(jù)以中位數(shù)表示，IL-38和IL-36R mRNA相對(duì)含量組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，IL-38和IL-36R mRNA表達(dá)量之間的關(guān)系采用Spearman相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1IL-38及其受體IL-36RmRNA在CRC中的表達(dá)CRC組織中IL-38及其受體IL-36R mRNA的相對(duì)含量中位數(shù)分別為0.68和0.33，明顯高于癌旁正常組織中的含量(0.23和0.07)。CRC組織與癌旁正常組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.944、-3.254，P=0.003、0.001)。

2.2IL-38和IL-36RmRNA的表達(dá)與CRC臨床特征的相關(guān)性IL-38和IL-36R mRNA在臨床Ⅲ～Ⅳ期CRC組織中的相對(duì)含量明顯高于臨床Ⅰ～Ⅱ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IL-38和IL-36R mRNA在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CRC組織中的相對(duì)含量明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IL-38和IL-36R mRNA在不同分化程度CRC組織中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 IL-38及其受體IL-36R mRNA表達(dá)與CRC臨床特征的相關(guān)性Tab 1 Correlation of the clinical features of colorectal cancer and the expressions of IL-38 and its receptor IL-36R mRNA

2.3IL-38和IL-36RmRNA相關(guān)性分析對(duì)CRC組織中IL-38和IL-36R mRNA表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，IL-38與IL-36R mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.63，P<0.001)。

3 討論

多項(xiàng)研究表明，炎癥反應(yīng)參與CRC的發(fā)病，CRC圍手術(shù)期應(yīng)用腸道微生態(tài)制劑可減少腸道致病菌數(shù)量、降低術(shù)后炎癥反應(yīng)、抑制感染和降低并發(fā)癥的發(fā)生率[9]。這一過(guò)程涉及多個(gè)細(xì)胞因子，例如IL-1[2-5]。IL-1包括IL-1α和IL-1β兩個(gè)成員，過(guò)表達(dá)IL-1α和IL-1β均可促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管形成等[10-11]。外源性給予IL-1受體拮抗劑(IL-1Ra)可抑制CRC細(xì)胞增殖、侵襲，并提高抗腫瘤藥物的輸送能力[12]。新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子IL-38屬于IL-1家族成員，位于人類(lèi)第2號(hào)染色體長(zhǎng)臂1區(qū)4帶1亞帶，長(zhǎng)約7.8 kb，包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。IL-38在序列上與IL-1Ra和IL-36受體拮抗劑(IL-36Ra)高度同源，可能具有類(lèi)似的生物學(xué)功能。由此推測(cè)，IL-38可能介導(dǎo)了CRC的病理學(xué)進(jìn)程。

本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)62例CRC和對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中IL-38及其受體IL-36R mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CRC組織中IL-38和IL-36R mRNA均顯著高表達(dá)，且在臨床Ⅲ～Ⅳ期和伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CRC患者中表達(dá)升高更為明顯，提示IL-38和IL-36R參與CRC的病理進(jìn)展，抑制IL-38和IL-36R的表達(dá)有望成為CRC新的治療途徑。此外，本研究還對(duì)IL-38和IL-36R mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者呈高度正相關(guān)，表明IL-38通過(guò)與其受體IL-36R結(jié)合傳遞信號(hào)介導(dǎo)CRC的發(fā)生。該研究結(jié)果與TAKADA等[6]的報(bào)道一致。TAKADA等[6]研究檢測(cè)了417例原發(fā)性肺腺癌中IL-38蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IL-38呈高表達(dá)，高表達(dá)IL-38的患者腫瘤體積更大、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移更多、臨床分期更晚、更易出現(xiàn)胸膜和血管侵襲、總生存期和無(wú)病生存期更短，且程序性細(xì)胞死亡配體1表達(dá)陽(yáng)性。目前，IL-38介導(dǎo)CRC發(fā)病的分子機(jī)理尚不明確，推測(cè)可能影響了宿主免疫力和/或腫瘤微環(huán)境進(jìn)而參與腫瘤的演變過(guò)程。

綜上所述，本研究首次報(bào)道了CRC組織中IL-38及其受體IL-36R mRNA顯著高表達(dá)，兩者表達(dá)呈正相關(guān)，臨床Ⅲ～Ⅳ期和伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中表達(dá)更高，提示IL-38通過(guò)與其受體IL-36R結(jié)合參與了CRC的發(fā)生、發(fā)展。未來(lái)有必要深入探討其分子機(jī)制，為尋求CRC治療新靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。