汪丹 吳成鳳 申文

[摘要] 目的 研究瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1（TRPV1）基因多態(tài)性與肺癌中晚期癌痛患者阿片藥物需要量的關(guān)聯(lián)性。方法 選擇2016年12月～2017年5月在徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院住院的肺癌中晚期（Ⅲ、Ⅳ期）患者191例（肺癌組）及健康體檢者52名（健康對(duì)照組）。收集其外周靜脈血標(biāo)本，采用聚合酶鏈反應(yīng)限制性酶切片段多態(tài)性（PCR-RFLP）方法對(duì)其進(jìn)行TRPV1基因rs222747、rs8065080兩個(gè)位點(diǎn)的基因型和等位基因分析，隨機(jī)選擇部分樣品應(yīng)用直接測(cè)序法驗(yàn)證其分型結(jié)果。采用視覺模擬量表評(píng)分法（VAS）對(duì)患者進(jìn)行疼痛評(píng)估，應(yīng)用嗎啡當(dāng)量比較不同基因型患者阿片藥物的需要量。 結(jié)果 肺癌組和健康對(duì)照組TRPV1基因rs222747位點(diǎn)、rs8065080位點(diǎn)均可檢出3種基因型：rs222747（CC、GC、GG），rs8065080（CC、TC、TT）。肺癌組與健康對(duì)照組rs222747位點(diǎn)的基因型和等位基因分布顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），而肺癌組與健康對(duì)照組rs8065080位點(diǎn)的基因型和等位基因分布顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。肺癌組rs222747位點(diǎn)各基因型和等位基因患者的阿片藥物日均需要量、體重標(biāo)化日均需要量、體重表面積標(biāo)化日均需要量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 尚不能認(rèn)為TRPV1基因rs222747位點(diǎn)基因多態(tài)性與肺癌中晚期癌痛患者阿片藥物需要量有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1；基因多態(tài)性；肺癌；癌痛

[中圖分類號(hào)] R730.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）09（a）-0087-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between transient receptor potential vanilloid 1 （TRPV1） gene polymorphisms and opioid requirements in patients with advanced lung cancer. Methods Peripheral venous blood samples were collected from 191 patients with advanced lung cancer （stages Ⅲ and Ⅳ） （lung cancer group） and 52 healthy controls （healthy control group） in Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University from December 2016 to May 2017. The genotypes of rs222747 and rs8065080 of TRPV1 were analyzed by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism （PCR-RFLP）. Part of samples were randomly selected and verified by direct sequencing method. Visual analogue scale （VAS） was used to evaluate the pain of patients and morphine equivalents were used to compare the requirements of opioids for patients with different genotypes. Results Three genotypes were detected in lung cancer group and healthy control group： rs222747 （CC， GC， GG） and rs8065080 （CC， TC， TT）. There was no significant difference in the genotype and allele distribution of rs222747 between the lung cancer group and healthy control group （P > 0.05）. The distribution of genotypes and alleles of the rs8065080 between the lung cancer group and the healthy control group were statistically significant（P < 0.05）. There was no significant difference in the 24 h-opioids doses， weight-adjusted-24 h-opioids doses， weight-surface area-adjusted-24 h-opioids doses between the genotypes and alleles of rs222747 in the lung cancer group with pain（P > 0.05）. Conclusion There is insufficient evidence that the rs222747 polymorphisms of TRPV1 are associated with the requirement of opioids in advanced lung cancer patients with pain.

[Key words] Transient receptor potential vanillic acid subtype 1； Gene polymorphism； Lung cancer； Cancer pain

在全球范圍內(nèi)，諸多癌癥患者正飽受疼痛的煎熬。疼痛的影響因素有很多，包括生理、認(rèn)知、情緒和基因等方面[1]。疼痛感知的個(gè)體差異在癌癥病人中表現(xiàn)尤為突出[2]，其中基因因素是引起這種差異的重要原因[3]。目前，癌痛的藥物治療均采用WHO癌癥疼痛三階段治療原則，但阿片類藥物的長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致嗜睡、便秘、惡心嘔吐、呼吸抑制、耐受性和成癮性等副作用[4]。阿片類藥物的鎮(zhèn)痛效果以及不良反應(yīng)除了與個(gè)體藥代動(dòng)力學(xué)有關(guān)，遺傳因素也同樣發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，攜帶ABCB1 3435TT基因型、TT單倍體的患者對(duì)阿片類藥物治療效果較佳，所需藥物劑量較低[5]。

TRPV1屬于瞬時(shí)受體電位（transient receptor potential，TRP）家族中的TRPV（vanilloid）亞家族，高表達(dá)于三叉神經(jīng)節(jié)（TG）、背根神經(jīng)節(jié)（DRG）等的外周和中樞小直徑感覺神經(jīng)元末端[6]。研究發(fā)現(xiàn)，TRPV1基因rs8065080位點(diǎn)C-T突變以及rs222747位點(diǎn)C-G變或變異在蛋白水平上可導(dǎo)致氨基酸的改變[7]，使其表現(xiàn)的性質(zhì)發(fā)生改變。本研究即選取TRPV1基因rs222747、rs8065080位點(diǎn)，探索TRPV1基因多態(tài)性與肺癌中晚期癌痛患者阿片藥物需要量的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

選擇2016年12月～2017年5月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）肺癌中晚期（Ⅲ、Ⅳ期）患者191例作為肺癌組，選擇同期我院體檢中心健康對(duì)照者52名作為健康對(duì)照組。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且入組患者或其家屬均已知情同意并簽署知情同意書。癌癥患者病例按照2012年發(fā)表在中國(guó)肺癌雜志上的《原發(fā)性肺癌診療規(guī)范》的標(biāo)準(zhǔn)[8]。納入標(biāo)準(zhǔn)：①按上述標(biāo)準(zhǔn)確診為肺癌中晚期患者；②未接受化療者；③性別不限，年齡18～80歲；④神志清楚，無交流障礙。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有嚴(yán)重精神疾病或神志不清者；②患有嚴(yán)重心、腦血管疾病，肝、腎功能嚴(yán)重?fù)p害者；③有酒精成癮或藥物濫用史；④患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道疾病者；⑤合并有其他慢性疼痛患者；⑥阿片耐受者。

肺癌組男125例，女66例，平均年齡（62.38±10.96）歲；健康對(duì)照組男27名，女25名，平均年齡（59.13±10.35）歲；兩組性別構(gòu)成比、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.07、0.06），具有可比性。

1.2 方法

應(yīng)用視覺模擬量表評(píng)分法（VAS）[9]對(duì)患者進(jìn)行疼痛評(píng)估。應(yīng)用嗎啡當(dāng)量進(jìn)行藥物劑量的比較，見表1。本研究中所應(yīng)用阿片藥物需求量的計(jì)算方法主要有3種：24 h-阿片劑量、體重-24 h-阿片劑量、體重-體表面積-24 h-阿片劑量[10]。

1.2.1 基因組DNA的提取 入組患者采集EDTA抗凝的外周靜脈血，采用DNA提取試劑盒法分別進(jìn)行血液基因組DNA（上海賽百盛基因技術(shù)有限公司）的提取。

1.2.2 引物 PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，rs222747位點(diǎn)：上游引物5′-CAGAGACAGAGGGAGTTTGGA-3′，下游引物5′-ACACA-CAGATAGCGACGCCA-3′；rs8065080位點(diǎn)：上游引物5′-CAAGTCCTGGAGCTCATTTCA-3′，下游引物5′-GCCCTGACCCAGGTATGTGTA-3′。兩位點(diǎn)上、下游引物均由上海生物工程公司合成，-20℃保存，引物使用前稀釋成10 μmol/L。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增應(yīng)用PCR擴(kuò)增儀，反應(yīng)體系：濃度為10 μmol/L的上下游引物各1 μL，2×PCR mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。依次進(jìn)行：95℃預(yù)變性4 min；95℃變性30 s，62℃退火30 s（rs8065080退火溫度為57℃），72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。rs222747、rs8065080位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增目的基因產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為487、486 bp。

1.2.4 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析 TRPV1基因rs222747位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物限制性酶切反應(yīng)體系為50 μL：10×NEB 緩沖液5 μL，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，限制性內(nèi)切酶BsaBI（上海生物工程公司）1 μL，滅菌水34 μL，65℃暖烘箱2 h，2%瓊脂糖凝膠電泳，DNA Marker（DL50 bp）為參照，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并判斷基因型（rs8065080位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶Hpy99I，烘箱1 h）。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物與目的片段長(zhǎng)度相符。見圖1。

1.2.5 PCR-RFLP 的方法學(xué)驗(yàn)證 在試驗(yàn)結(jié)果中分別隨機(jī)抽取部分用PCR-RFLP方法得出的rs222747、rs8065080位點(diǎn)突變雜合子、野生純合子、突變純合子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。見圖2。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料用四分位數(shù)間距（P25，P75）表示；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組TRPV1基因 rs222747和rs8065080位點(diǎn)的基因型與等位基因分布

肺癌組與健康對(duì)照組TRPV1基因rs222747位點(diǎn)的基因型和等位基因分布顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），見表2。rs8065080位點(diǎn)的基因型和等位基因分布顯示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），見表3。因不能排除其與肺癌癌癥的關(guān)系，故不予進(jìn)行肺癌疼痛組rs8065080位點(diǎn)的基因多態(tài)性與阿片藥物需要量關(guān)系的下一步研究。

2.2 TRPV1 rs222747位點(diǎn)基因多態(tài)性對(duì)肺癌中晚期患者阿片藥物需要量的影響

肺癌組患者的基本資料比較顯示不同基因型及等位基因患者年齡、性別、腫瘤分期比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），見表4。不同基因型及等位基因型患者阿片藥物需要量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），見表5。即尚不能認(rèn)為TRPV1基因rs222747位點(diǎn)的基因多態(tài)性對(duì)肺癌中晚期患者阿片藥物需要量有影響。

3 討論

在癌痛的形成因素中，傷害性感受器發(fā)揮著極其重要的作用。其中，兩個(gè)主要類型是無髓鞘的C纖維以及有髓鞘的Aδ纖維[11]。這些神經(jīng)纖維通過將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)并形成動(dòng)作電位，從而將有害的信息迅速傳至大腦。在這個(gè)過程中，陽離子通道如瞬時(shí)受體電位（TRP）通道已經(jīng)被確定為主要疼痛受體[12]。

隨著人們對(duì)基因研究的深入，一些與疼痛密切相關(guān)的基因逐漸被認(rèn)知，以陽離子通道SCN9A[13]、TRPV1[14]、阿片受體基因OPRM1[15]、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp[16]、藥物代謝酶兒茶酚O-甲基轉(zhuǎn)移酶COMT[17]、炎性因子白細(xì)胞介素-1[18]等居多。Gong等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在ABCB1 C3435T各基因型中，TT基因型患者的體重-表面積標(biāo)化阿片藥物日均需要量要少于CC/CT基因型患者。本研究比較分析肺癌組中TRPV1 rs222747位點(diǎn)不同基因型及等位基因患者其阿片藥物日均需要量、體重標(biāo)化日均需要量、體重-體表面積標(biāo)化日均需要量的差異，結(jié)果均顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。免疫組化顯示在背根神經(jīng)節(jié)（DRG）細(xì)胞中μ和δ阿片受體TRPV1共區(qū)域化[19]，阿片樣物質(zhì)和TRPV1相互作用的胞內(nèi)調(diào)節(jié)器可能為蛋白激酶A（PKA），PKA可敏化TRPV1并增強(qiáng)DRG神經(jīng)元中的TRPV1電流[20]，而阿片類藥物可抑制環(huán)腺苷單磷酸（cAMP）形成和PKA活化，從而減弱TRPV1介導(dǎo)疼痛的作用。

分析本研究結(jié)果考慮有以下兩方面原因：第一，TRPV1 rs222747位點(diǎn)上單個(gè)核苷酸的改變可能并未引起通道功能的改變；第二，癌痛患者阿片藥物需要量可能還與患者疼痛程度有關(guān)?；蚨鄳B(tài)性與阿片藥物的鎮(zhèn)痛效應(yīng)之間的關(guān)系很復(fù)雜，可能受種族、環(huán)境、疼痛類型、疾病嚴(yán)重程度以及基因相互作用等方面因素的影響，選取單一的SNP位點(diǎn)改變代表TRPV1基因多態(tài)性對(duì)阿片藥物需要量進(jìn)行分析尚不全面，選取位點(diǎn)、多個(gè)基因相互作用及其單倍體分析進(jìn)行研究會(huì)更全面、更有意義。

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（收稿日期：2018-04-02 本文編輯：任 念）