仲麗麗 張維嘉 劉旭

[摘要] 目的 探討通天草醇提物對阿爾茨海默病小鼠學習能力、記憶能力、學習記憶保持能力等行為學及海馬炎癥介質白細胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子α（TNF-α）含量的影響。 方法 根據隨機數字表法將48只雄性C57BL/6小鼠分為六組：模型組、正常組、多奈哌齊組和通天草醇提物高、中、低劑量組，每組8只。采用Aβ1-42（80 pmol/μL）雙側腦室注射的方法誘導阿爾茨海默病模型，各組實驗開始每天灌胃1次，多奈哌齊組小鼠給予0.000 92 g/（kg·d）灌胃，通天草醇提物高、中、低劑量組小鼠分別給予3.96、1.98、0.99 g/（kg·d）灌胃，而正常組和模型組小鼠給予生理鹽水灌胃，連續(xù)治療35 d。采用Morris水迷宮檢測阿爾茨海默病小鼠行為學的改變，酶聯(lián)免疫吸附法檢測阿爾茨海默病小鼠海馬IL-1β、TNF-α含量。 結果 模型組小鼠的逃避潛伏期及游泳距離增加，同時伴有目標停留時間縮短和跨平臺次數減少，尋找到水迷宮系統(tǒng)水下平臺所需要的時間較長，與正常組比較，模型組小鼠行為學出現(xiàn)明顯異常（P < 0.05）；與正常組比較，模型組海馬炎癥介質IL-1β、TNF-α水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；與模型組比較，通天草醇提物高、中劑量組小鼠行為學明顯改善，海馬IL-1β、TNF-α水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。 結論 通天草醇提物能夠改善小鼠的學習能力和記憶障礙，降低炎性反應并緩解血腦屏障損傷，在阿爾茨海默病治療中發(fā)揮重要作用。

[關鍵詞] 通天草；阿爾茨海默??；行為學；炎癥介質

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）09（a）-0017-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of alcohol extract of Waternut Herb on learning ability， memory ability， learning and memory retention ability of mice with Alzheimer disease， and the effects of interleukin （IL）-1β and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in hippocampal inflammation media. Methods Forty-eight male C57BL/6 mice were divided into six groups according to the random number table method： model group， normal group， Donepezil group， and high， medium， low dose of alcohol extract of Waternut Herb group， with 8 mice in each group. Alzheimer disease model was induced by bilateral intracere broventricular injection of Aβ1-42 （80 pmol/μL）. Each group of rats was given intragastric administration once a day. The mice in Donepezil group were given 0.000 92 g/（kg·d） by gavage. The mice in the high， medium， low dose of alcohol extract of Waternut Herb group were given 3.96， 1.98， 0.99 g/（kg·d） by gavage， respectively. While the mice in the normal group and model group were given intragastric administration with continuous saline， treatment for 35 days. The Morris water maze was used to detect the changes of behavior in Alzheimer disease mice. The levels of IL-1β and TNF-α in hippocampus of Alzheimer disease mice were determined by enzyme-linked immunosorbent assay. Results The incubation period and swimming distance of mice in the model group were increased. At the same time， the target residence time was shortened and the number of cross-platforms was reduced， it took a long time to find the underwater platform of the water maze system， compared with the normal group， the abnormal behavior in the model group was significantly increased （P < 0.05）. Compared with the normal group， the levels of IL-1β and TNF-α of the inflammatory mediators of the hippocampus in model group were significantly increased （P < 0.05）. Compared with the model group， the behavior of mice in the high and medium doses of alcohol extract of Waternut Herb group was significantly improved， and the levels of IL-1β and TNF-α in the hippocampus were significantly decreased， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Alcohol extract of Waternut Herb can improve the learning ability and memory impairment of mice， reduce the inflammatory response and relieve blood-brain barrier injury， and plays an important role in the treatment of Alzheimer disease.

[Key words] Waternut Herb； Alzheimer disease； Behavioristics； Inflammatory mediators

阿爾茨海默病是一種進行性的逐漸發(fā)展的神經變性疾病之一[1-2]，其特征為神經元外沉積β-淀粉樣蛋白和神經元內Tau蛋白形成的神經原纖維纏結[3]。β-淀粉樣蛋白積累后誘導小膠質細胞活化和促進炎癥介質上調[4]，還能誘發(fā)學習記憶能力減退，引起行為學異常[5-6]。阿爾茨海默病神經血管假說證實，β-淀粉樣蛋白產生和清除平衡破壞導致腦β-淀粉樣蛋白水平增加引起血管毒性，神經性炎性反應是阿爾茨海默病發(fā)病的重要環(huán)節(jié)[7-8]，可見，阿爾茨海默病出現(xiàn)行為學異常與炎癥介質異常是常見的。

據研究，通天草對阿爾茨海默病模型學習記憶[9]、形態(tài)學[10]、細胞凋亡[11]、NF-κB p65[12]、血腦屏障[13]、β-淀粉樣蛋白前體蛋白[14]等有改善作用，對肝纖維化、抑郁模型小鼠行為具有改善作用[15-16]。本實驗采用通天草醇提物，以Aβ1-42誘導阿爾茨海默病小鼠模型為研究對象，探討通天草醇提物對阿爾茨海默病小鼠行為學和炎癥介質的影響，期望為防治阿爾茨海默病奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級6月齡雄性C57BL/6小鼠68只，體重（22±2）g，購于黑龍江中醫(yī)藥大學動物中心[許可證號SCXK（黑）2013-012]，小鼠在常溫常濕設施環(huán)境內自由攝取食物且分籠飼養(yǎng)。

1.1.2 試劑 通天草醇提物由黑龍江中醫(yī)藥大學中藥研究院提供；鹽酸多奈哌齊（重慶植恩藥業(yè)公司，批號：20141201）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β、酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20140401）；Aβ1-42（北京博奧森公司，批號：bs-0107p）。

1.1.3 儀器 RT-雷杜酶標儀6100型（美國RT公司）；腦立體定位儀STW-1型（成都儀器制造廠）；臺式全自動離心機TGL-16G型（上海安亭科學儀器廠）；Morris水迷宮系統(tǒng)ZH-DSG型（安徽淮北正華生物儀器公司）等。

1.2 方法

1.2.1 阿爾茨海默病模型 參考文獻[17-23]制備阿爾茨海默病小鼠模型。各組小鼠用水合氯醛麻醉，將其固定，剃掉頭頂上的毛露出顱骨，用腦立體定位儀定位海馬，微量加樣器一次性注入10 μg凝聚態(tài)Aβ1-42（80 pmol/μL）注進雙側腦室海馬區(qū)，停留10 min緩慢退，骨蠟封閉，將其包扎，青霉素消炎預防感染；正常組給予等量生理鹽水注射雙側腦室。實驗造模前初始小鼠48只，造模后死亡5只，經過水迷宮系統(tǒng)篩查，優(yōu)選40只學習記憶能力較差（60 s內不可尋找到Morris水迷宮系統(tǒng)第Ⅳ象限平臺）小鼠為阿爾茨海默病模型。

1.2.2 分組與給藥 按照隨機數字表法將40只阿爾茨海默病小鼠模型分為模型組、多奈哌齊組和通天草醇提物高、中、低劑量組，每組8只，同時選擇健康6月齡雄性C57BL/6小鼠8只為正常組。其中多奈哌齊組小鼠給予0.000 92 g/（kg·d）灌胃，通天草醇提物高、中、低劑量組小鼠分別給予3.96、1.98、0.99 g/（kg·d）灌胃，而正常組和模型組小鼠則給予生理鹽水灌胃，各組給藥35 d。

1.2.3 測定學習能力 灌胃結束后經過1 d休整期，參考文獻[18，23]采用Morris水迷宮系統(tǒng)測定小鼠學習能力，水深20 cm，直徑12 cm，（23±2）℃水溫，平臺放于水迷宮系統(tǒng)第Ⅳ象限，經過1～4 d訓練后，各組小鼠學習能力不斷提高，每次訓練實踐60 s，若60 s未找到平臺，將小鼠放第Ⅳ象限平臺15 s潛伏期為60 s，第5天使用水迷宮系統(tǒng)測定小鼠逃避潛伏期評價小鼠學習能力。

1.2.4 測定記憶能力 實驗結束后過程同“1.2.3”，第5天撤去第Ⅳ象限平臺，檢測在60 s內小鼠找到水迷宮系統(tǒng)第Ⅳ象限平臺的游泳距離，評價小鼠記憶能力。

1.2.5 測定學習記憶保持能力 實驗結束后過程同“1.2.3”，在第5天撤去第Ⅳ象限平臺，檢測在60 s內小鼠在平臺所在水迷宮系統(tǒng)第Ⅳ象限目標停留時間（游泳時間）和跨平臺次數（跨越平臺所在位置次數），用以學習記憶保持能力的評價。

1.2.6 測定海馬炎癥介質IL-1β、TNF-α含量 將實驗小鼠斷頭處置放在冰袋上迅速取出海馬，然后勻漿，放入離心機5000 r/min離心10 min，r = 5 cm，按組分裝，-20℃保存樣品。用RT-雷杜酶標儀6100型450 nm波長測定各孔組織吸光度（A），繪制標準曲線，按照方程測定IL-1β、TNF-α含量。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析各組的數據結果，兩兩之間比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 通天草醇提物對阿爾茨海默病小鼠學習能力的影響

與正常組比較，模型組小鼠逃避潛伏期延長，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；與模型組比較，多奈哌齊組和通天草醇提物高、中劑量組小鼠逃避潛伏期明顯縮短，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 通天草醇提物對阿爾茨海默病小鼠記憶能力的影響

與正常組比較，模型組小鼠游泳距離延長，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；而與模型組比較，多奈哌齊組和通天草醇提物高、中劑量組小鼠游泳距離明顯縮短，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表2。

2.3 通天草醇提物對阿爾茨海默病小鼠學習記憶保持能力的影響

與正常組比較，模型組小鼠在目標停留時間明顯縮短，跨躍平臺次數也顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；與模型組比較，多奈哌齊組和通天草醇提物高、中劑量組小鼠目標停留時間則明顯延長，跨躍平臺次數也明顯提高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表3。

2.4 通天草醇提物對阿爾茨海默病小鼠海馬炎癥介質的影響

與正常組比較，模型組小鼠海馬IL-1β、TNF-α含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；與模型組比較，多奈哌齊組和通天草醇提物高、中劑量組小鼠IL-1β、TNF-α含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表4。

3 討論

阿爾茨海默病初期會有學習記憶能力減退，腦組織有淀粉樣物的沉積，其機體腦組織小膠質細胞吞噬β-淀粉樣蛋白，隨著β-淀粉樣蛋白的產生而隨之增加，小膠質細胞吞噬作用減弱，逐漸激活小膠質細胞的分泌能力，繼而產生大量的炎癥介質，反過來激活小膠質細胞和星形膠質細胞產生放大效應，促進β-淀粉樣蛋白增加，進而加速阿爾茨海默病進程[24-27]。

本研究水迷宮實驗顯示，模型組小鼠的潛伏期及游泳距離增加，同時伴有目標停留時間縮短和跨平臺次數減少，尋找到水迷宮系統(tǒng)水下平臺所需要時間較長，說明模型組小鼠學習記憶能力減退，動物實驗模型建立成功可用于后續(xù)實驗。而經過通天草醇提物藥物治療后，高、中劑量組小鼠與模型組相比逃避潛伏期明顯縮短，游泳距離減少，目標停留時間則明顯延長，跨躍平臺次數也提高，可促使模型組小鼠較快地尋找到水迷宮水下平臺，預示著通天草醇提物高、中劑量可以改善阿爾茨海默病小鼠學習記憶能力，對其行為學具有改善作用。本研究還檢測了阿爾茨海默病小鼠海馬中炎癥介質IL-1β、TNF-α的含量，結果顯示，模型組小鼠海馬IL-1β、TNF-α含量增加，而通天草醇提物治療后，其高、中劑量可下調小鼠海馬IL-1β、TNF-α含量，對小鼠學習記憶能力有改善作用，提示通天草醇提物高、中劑量可以改善小鼠的行為學，這可能與小鼠海馬炎癥介質IL-1β、TNF-α含量的降低有關。

綜上所述，通天草醇提物能夠改善小鼠學習能力和記憶障礙，降低炎性反應，并緩解血腦屏障損傷，以此在阿爾茨海默病治療中發(fā)揮重要作用。

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（收稿日期：2018-03-09 本文編輯：張瑜杰）