馮源恒 楊章旗 譚健暉 李火根 陳新華

(廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，南寧，530002) (南京林業(yè)大學(xué)) (南寧市林業(yè)科學(xué)研究所)

隨著林木育種理論的不斷發(fā)展，育種群體的結(jié)構(gòu)化已成為制定育種策略的重要部分。將規(guī)模較大的育種群體結(jié)構(gòu)細化，有利于育種材料的管理，降低雜交育種成本，充分發(fā)揮優(yōu)異親本的價值。目前已有多種育種群體的結(jié)構(gòu)設(shè)計應(yīng)用在林木上。如“核心群體”策略[1-2]、“亞系”策略[3-4]、“多重群體”策略[5]等。

馬尾松(PinusmassonianaLamb.)是我國南方最重要的造林樹種之一，也是我國林業(yè)科研領(lǐng)域長期重點研究的樹種[6]。我國馬尾松種質(zhì)資源豐富，南方各主要馬尾松分布省區(qū)都建立規(guī)模較大育種群體，以有效地保存遺傳多樣性，從而在長期育種中獲得更高的遺傳增益[7]。但育種群體規(guī)模越大，對育種材料的管理難度也隨之增加。為了在早期改良中獲得較大的遺傳增益，保證長期育種計劃得以持續(xù)，應(yīng)充分利用優(yōu)良育種材料的優(yōu)勢，有效控制近交發(fā)生。因此，科學(xué)設(shè)計育種群體結(jié)構(gòu)，建立核心育種群體尤為重要。

廣西馬尾松第1代育種群體構(gòu)建于上世紀80年代，由464個無性系組成。1987—1994年間，陸續(xù)開展了種子園自由授粉子代的測定，共建立子代測定林11片共29 hm2[8]。育種群體規(guī)模較大既為高世代遺傳改良研究提供了較豐富的遺傳多樣性基礎(chǔ)，也給育種群體的遺傳管理帶來難度。同時，選擇精英育種群體和1.5代生產(chǎn)性種子園的材料時如何避免近交也是第一代改良中急需解決的問題。而對育種群體進行科學(xué)的亞系劃分，將較大育種群體細化為較小育種單元，可以使遺傳改良研究更為精細，在追求改良增益的同時實現(xiàn)對近交的有效控制。此為，本研究跟據(jù)馬尾松第1代育種群體半同胞子代測定試驗數(shù)據(jù)，估算各親本的育種值，并結(jié)合SSR分子標(biāo)記技術(shù)根據(jù)遺傳距離對育種群體進行亞系結(jié)構(gòu)劃分，將遺傳距離較近的親本劃入同一亞系。以選擇高育種值無性系，并以控制群體近交水平為原則，構(gòu)建馬尾松第1代核心育種群體，從而為馬尾松育種材料的科學(xué)管理提供技術(shù)支持，并為高世代雜交育種試驗提供骨干親本。

1 材料與方法

研究材料為南寧市林科所馬尾松國家級良種基地的馬尾松第一代育種群體464個無性系。廣西馬尾松第一代育種群體構(gòu)建于上世紀80年代，以生長量為主要改良性狀。材料源自1976年、1977年及1984年對廣西全境的馬尾松人工林和優(yōu)良種源的天然優(yōu)良林分進行優(yōu)樹選擇所得的速生性狀優(yōu)良單株[7-8]。其中有153個選自廣西桐棉、古蓬、容縣3大優(yōu)良種源區(qū)的馬尾松天然林，有311個選自廣西境內(nèi)30個國有林場的人工林。所有育種群體材料均以無性系形式(每個無性系8株)保存于2010年新建的馬尾松基因庫中[9]。2012年6月采集每個無性系的新鮮針葉并冷凍保存。

以1988年、1992年和1994年分別在南寧市林科所營造的馬尾松第一代育種群體半同胞子代測定試驗為材料計算親本育種值。8個子代測定試驗共測定來自440個無性系(另有24個無性系未進行測定)的901個半同胞家系，所有家系均來自南寧林科所馬尾松初級種子園。子代測定林具體情況見表1。

表1 各子代測定試驗概況

1.1 DNA的提取

松樹針葉DNA提取采用CTAB裂解—硅珠吸附法[10]。DNA純化后，經(jīng)分光光度計檢測純度，并置于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物來源及SSR-PCR試驗技術(shù)

使用16對SSR引物用于育種群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。該批引物基于馬尾松基因組測序開發(fā)得到[11]。引物由上海捷瑞基因技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為10 μL：Tris-HCl 10 mmol/L pH8.0，KCl 50 mmol/L，Mg2+2.5 mmol/L，dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.2 mmol/L)。引物2.5 pmol，Taq聚合酶0.8 U，DNA 10～20 ng。擴增反應(yīng)程序采用Touch-down PCR：94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s(Δ℃=-0.5)，72 ℃ 30 s，16個循環(huán)；在進入94 ℃ 15 s，52 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，10個循環(huán)；最后72 ℃延伸15 min[11]。SSR-PCR產(chǎn)物在8%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，并照相記錄[12]。其顯帶的記錄方法為:電泳圖上目的片段范圍內(nèi)，清晰、重復(fù)的條帶，根據(jù)分子質(zhì)量大小，從大到小依次記作A、B、C、D、…、1條為純合，2條為雜合，分別記錄為aa，ab，bb，ac，ad，cd等，按照等位基因的位置不同而不同，從而獲得原始的數(shù)據(jù)。

1.3 遺傳多樣性分析方法

采用POPGEN32軟件[13]計算遺傳距離(Genetic Distance，GD)[14]，據(jù)此采用軟件NTSYS軟件按非加權(quán)類平均法(unweighted pair group method with arithmetic averaging，UPGMA)進行聚類分析。采用Coancestry Version 1.0軟件[15]計算群體內(nèi)的近交系數(shù)Θ[16-19]。

1.4 育種值計算方法

根據(jù)子代測定試驗的樹高、胸徑測定結(jié)果，采用公式1.1計算材積[20]。

V=0.714 265 437×10-4D1.867 008H0.901 463 2。

最佳線性無偏估計公式育種值，利用混合模型方程組求解。上述線性模型的矩陣表達式為:

Y=Xβ+Zu+e。

式中,β=(μ,B1,…,Bb)′為區(qū)組固定效應(yīng)向量；u=(F1,F2,…,Ff)′為家系的隨機效應(yīng)向量；e是隨機誤差效應(yīng)向量；X、Z分別是相應(yīng)項的設(shè)計矩陣。計算育種值的混合模型方程為

采用ASReml軟件依據(jù)上述模型計算家系的親本無性系育種值[22]。

1.5 育種群體亞系劃分

根據(jù)3個原則對育種群體進行亞系劃分：(1)控制近交水平；(2)降低單元內(nèi)育種親本的數(shù)量；(3)優(yōu)良無性系均勻分布在各個亞系。首先根據(jù)SSR分析結(jié)果，計算親本間遺傳距離[14]，并進行遺傳聚類。然后采用ASReml軟件根據(jù)子代測定數(shù)據(jù)估算得到440個無性系材積性狀的育種值。采用SAS軟件以xij=u+βi+εij為線性模型分別對不同層次聚類分支間的育種值進行方差分析，式中：xij表示來自第i個分支、第j個親本的育種值；u表示總體平均值；βi表示分支效應(yīng)；εij為隨機誤差。如不存在顯著差異說明該層聚類分支間優(yōu)良無性系分布均勻，可作為劃分亞系的依據(jù)。

1.6 核心群體材料選擇方法

根據(jù)3個原則選擇核心群體材料：(1)入選無性系具有較高育種值；(2)控制無性系間親緣關(guān)系；(3)最大限度繼承第1代育種群體的遺傳多樣性。擬采用3種方案進行選擇。A方案：根據(jù)育種值對第1代育種群體進行整體選擇，選擇育種值最高的20%無性系作為核心群體。B方案：跟據(jù)亞系劃分結(jié)果，在亞系內(nèi)根據(jù)育種值選擇優(yōu)良無性系。C方案：在B方案基礎(chǔ)上，進行遺傳多樣性分析，對損失的等位基因進行補充。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣西馬尾松第一代育種群體遺傳聚類分析

根據(jù)16對SSR引物的擴增結(jié)果[9]，采用POPGEN32軟件計算得到464個無性系間的Nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離(DG)[14]，共得到107 800對無性系間遺傳距離，平均值為0.25。其中桂GC647A與桂GC710A間DG值最大，為1.33；最小的DG值出現(xiàn)在桂GC630A與桂GC483A間，為0.01。采用軟件NTSYS根據(jù)Nei氏遺傳距離[14]，按非加權(quán)類平均法(UPGMA)對464個無性系進行聚類分析。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，馬尾松1代育種群體的聚類結(jié)構(gòu)存在2個特征，一是無大規(guī)模的亞群結(jié)構(gòu)，二是聚類結(jié)構(gòu)與優(yōu)樹來源地?zé)o明顯的重合性。在已報道的許多植物種質(zhì)資源遺傳結(jié)構(gòu)研究中都發(fā)現(xiàn)大多數(shù)無性系集中分在幾個主要的大類群上并與原始選擇地點或分布區(qū)相對應(yīng)，如美國大麥及美國陸地棉都分為5個亞群，意大利蘋果則分為2個亞群[23-25]。而廣西馬尾松1代育種群體則未見集中分布亞群結(jié)構(gòu)，遺傳距離在0.29～0.31范圍內(nèi)，437個無性系較為均勻分布在16個聚類分支上，其余27個無性系零散分布在8個分支上。據(jù)此將464個無性系分為17個大類群，每個類群無性系數(shù)目為20～36。17個大類群下又可細分為34個小聚類群，每個小類群無性系數(shù)目5～24。大小聚類群與原始選擇地點均無明顯的對應(yīng)關(guān)系。

2.2 材積育種值估算及亞系結(jié)構(gòu)劃分

因為廣西馬尾松1代育種群體均為速生用材型無性系，所以使用材積指標(biāo)估算育種值。采用ASReml軟件根據(jù)子代測定數(shù)據(jù)估算得到440個無性系材積性狀的育種值。其中無性系桂GC415A育種值最高(0.094)，最低為桂GC1610A(-0.090),見表2。

根據(jù)遺傳聚類分析結(jié)果，采用SAS8.1軟件分別對17個大類群及34個小類群的無性系育種值進行方差分析，發(fā)現(xiàn)無性系材積性狀育種值在大類群間無顯著差異，在小類群差異顯著(p<0.05)。因此將廣西馬尾松第一代育種群體劃分17個亞系。為避免親本選配時出現(xiàn)近交情況并降低育種單元的無性系數(shù)量，在17個亞系下細化為34個組。將育種值排名前20%的無性系視為優(yōu)良無性系[26]，亞系桂GC1-J中優(yōu)良無性系數(shù)目最多，亞系桂GC1-K中優(yōu)良無性系數(shù)目比例最高。

表2 各亞系育種值信息

采用POPGENE32軟件對各亞系的遺傳多樣性進行分析。觀察等位基因數(shù)(Na)變化范圍在2.13～2.81。Shannon多樣性指數(shù)(I)變化范圍在0.43～0.74；觀測雜合度(Ho)變化范圍在0.34～0.48，近交系數(shù)變化范圍在0.007～0.119。

2.3 廣西馬尾松第一代核心育種群體取樣策略及有效性驗證

根據(jù)育種值進行整體選擇(A方案)所選出的無性系數(shù)量為88個，平均育種值0.054。16對SSR引物在這88個無性系中共擴增出46個等位基因，近交系數(shù)為0.094高于第1代育種群體。由表2可知，各亞系中優(yōu)良無性系的數(shù)量存在一定差異，僅根據(jù)育種值選擇核心群體材料則會選入許多親緣關(guān)系較近的無性系。且由于僅根據(jù)育種值進行選擇，該方案也造成了一定的低頻等位基因損失。

因此需平衡各亞系的入選數(shù)量，進一步精選。通過分析發(fā)現(xiàn)，各亞系中育種值在前10%無性系均為優(yōu)良無性系，這與季孔庶等[27]在對馬尾松無性系種子園進行家系選擇時的入選率相同。將此設(shè)定為核心群體材料的亞系內(nèi)選擇標(biāo)準(zhǔn)，并限定每個亞系入選無性系數(shù)量不能超過3個(B方案)。按此標(biāo)準(zhǔn)共選出47個無性系，平均育種值0.064。但研究發(fā)現(xiàn)16對SSR引物在這47個無性系中共擴增出44個等位基因，而第一代育種群體在這16個位點上共有51個等位基因。這表明在選擇中等位基因損失率為13.73%，見表3。

表3 各亞系遺傳多樣性

為了彌補等位基因的損失，研究從含有這些基因的無性系中選擇育種值最高的補充入核心群體(C方案)。經(jīng)補充的核心群體共有53個無性系，平均育種值為0.060，平均等位基因數(shù)(Na)3.19、平均有效等位基因數(shù)(Ne)1.77、遺傳多樣性指數(shù)(I)0.65、觀測雜合度(Ho)0.41。遺傳多樣性水平與第一代育種群體總體水平相當(dāng)[9]。核心群體近交系數(shù)為0.079，與第一代育種群體總體水平相同，見表4。

表4 3種選擇方案的遺傳多樣性

注：A方案：根據(jù)育種值對第1代育種群體進行整體選擇，選擇育種值最高的20%無性系作為核心群體。B方案：跟據(jù)亞系劃分結(jié)果，在亞系內(nèi)根據(jù)育種值選擇優(yōu)良無性系。C方案：在B方案基礎(chǔ)上，進行遺傳多樣性分析，對損失的等位基因進行補充。*該數(shù)據(jù)來自參考文獻[9]。

3 結(jié)論與討論

雜交親本選配是科學(xué)管理利用育種材料的核心環(huán)節(jié)。目前幾乎所有的育種群體結(jié)構(gòu)設(shè)計方法都是圍繞這一問題展開的，其設(shè)計思路的出發(fā)點有2個：一是實現(xiàn)對育種材料的分類管理，二是縮小基礎(chǔ)育種單元的規(guī)模。例如“多重群體”策略是按照不同的育種目標(biāo)性狀對材料進行分類管理[5]，而“核心群體”策略是按照育種材料的品質(zhì)進行分類管理[1]，“亞系”策略則更為重視縮小育種單元的規(guī)模[4]。就廣西的馬尾松而言，第一代育種群體具有規(guī)模大、育種目標(biāo)性狀一致、存在一定的近交情況(近交系數(shù)0.079)等特點。因此，對其進行結(jié)構(gòu)細化應(yīng)該重點考慮縮小基本育種單元規(guī)模和控制近交2個方面。研究跟據(jù)遺傳距離聚類結(jié)果對育種材料進行劃分管理，將亞系的規(guī)?？刂圃?6個無性系以內(nèi)，與美國濕地松的亞系規(guī)模接近[28-29]。并采用“亞系間雜交、亞系內(nèi)慎交”的雜交親本選配策略，有助于降低雜交試驗的近交水平。而且為了避免劃分單元過小造成優(yōu)良無性系分布不平衡狀況，本研究對不同劃分層次的單元間育種值差異進行了方差分析與檢驗?；诖?，在建立核心育種群體和1.5代生產(chǎn)性種子園時，可以依據(jù)無性系育種值的排名情況，從各亞系中較均勻的選取優(yōu)良無性系，以實現(xiàn)兼顧親本品質(zhì)與控制近交。

核心育種策略最早是在綿羊育種中提出的[1]。以后經(jīng)過Cotterill的修改、發(fā)展與實踐，應(yīng)用于樹木改良[2]。其核心思想是以精選出的核心群體在早期改良時更快的獲得遺傳增益，以主群體保持遺傳多樣性為長期育種服務(wù)。但以往的核心育種策略更為重視入選材料在目標(biāo)性狀上的表現(xiàn)，而對材料間的親緣關(guān)系及核心群體自身的遺傳多樣性考慮較少，完全依靠主群體對核心群體少量補充。因此也限制了該策略作為一種長期的林木育種策略的應(yīng)用。因此，本次對廣西馬尾松核心群體的選擇，在借鑒美國濕地松的群體結(jié)構(gòu)劃分策略[28-29]的基礎(chǔ)上有所創(chuàng)新。根據(jù)遺傳聚類將育種群體劃分為17個亞系，再從亞系中選擇優(yōu)良無性系組建核心群體?？墒购诵娜后w規(guī)模大為精簡，不但降低了育種成本，提高了改良工作的效率，還有效控制了近交程度。

但本研究發(fā)現(xiàn)單純的依據(jù)育種值選擇將造成一定比例稀有等位基因喪失?？紤]到馬尾松在廣西不但是用材、造紙、松脂產(chǎn)業(yè)的原料，而且也是荒山綠化、水土保持等方面重要的生態(tài)造林樹種。這就要求馬尾松良種子代具有豐富的遺傳多樣性，在改良初期損失過多的等位基因顯然是不利的。因此本研究在選擇核心群體時借鑒了“核心種質(zhì)”的部分理念，即選擇出一個小規(guī)模的群體既能獲得較高的改良增益又能最大程度的保持遺傳多樣性，使基因頻率較低的等位基因有較大機會在精選群體的改良過程中傳遞下去。研究結(jié)果表明，采用這種方法選出的核心群體遺傳多樣性幾乎沒有損失，而且平均育種值也沒有明顯下降。本次選出的核心群體為今后高世代育種提供了骨干親本。

綜上所述，依據(jù)遺傳距離及育種值對馬尾松第1代育種群體進行亞系結(jié)構(gòu)設(shè)計，不但可以有效控制雜交試驗的近交水平，還可以兼顧優(yōu)良無性系在亞系間分布均勻度。該方法可為馬尾松育種材料的科學(xué)管理提供技術(shù)支持。以此為基礎(chǔ)選擇出53個無性系組成廣西馬尾松第一代核心育種群體，為高世代雜交育種試驗提供了骨干親本。新組建的核心群體遺傳多樣性和近交水平與第1代育種群體總體水平相當(dāng)，但群體規(guī)模大為精簡，更便于采用全同胞交配設(shè)計。不但降低了育種成本，提高了改良工作的效率，還有效控制了近交程度。