柴文娟 楊杞 朱宏 張秀娟 李國婧 王瑞剛

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，呼和浩特，010018) (哈爾濱師范大學) (內(nèi)蒙古生物技術(shù)研究院) (內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學)

轉(zhuǎn)錄因子又被稱為反式作用因子，可以識別并特異性地結(jié)合基因啟動子上的順式作用元件。轉(zhuǎn)錄因子一般包含有DNA結(jié)合區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)、核定位信號區(qū)和寡聚化位點[1]。高等植物中的轉(zhuǎn)錄因子眾多，由于這些轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)合、轉(zhuǎn)錄、翻譯等方面的不同，被分為多個家族，主要包括MYB類轉(zhuǎn)錄因子家族、bZIP類轉(zhuǎn)錄因子家族、WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族、NAC轉(zhuǎn)錄因子家族以及AP2/EREBPA轉(zhuǎn)錄因子家族等。MYB類轉(zhuǎn)錄因子由于其編碼的蛋白質(zhì)含有一個或多個高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域—MYB結(jié)構(gòu)域而得名。每個MYB重復序列由51或52個氨基酸組成，并形成一個螺旋螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的結(jié)構(gòu)域，其中均勻分布的3個色氨酸殘基形成一個疏水核心[2-3]。在C端和保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間存在一個轉(zhuǎn)錄激活功能域，一般由大量酸性氨基酸組成，此外還有一個不完全界定的負調(diào)節(jié)域[4]。MYB類轉(zhuǎn)錄因子一般依據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域的重復數(shù)量在植物中被分成4個亞類：通常包含1個MYB結(jié)構(gòu)域的MYB-related亞類；包含2個MYB結(jié)構(gòu)域的R2R3-MYB亞類；包含3個連續(xù)結(jié)構(gòu)域的R1R2R3-MYB亞類以及4個MYB結(jié)構(gòu)域的4R-MYB亞類[5-6]。擬南芥R2R3-MYB亞類有126個成員，被分為22個亞組[1]。植物中第1個MYB轉(zhuǎn)錄因子是1987年從玉米(Zeemays)中分離得到的Clorless I CI[7]，之后越來越多的植物MYB類轉(zhuǎn)錄因子被鑒定出來。

由于不能主動躲避各種惡劣的自然環(huán)境，植物在長期的進化過程中被動適應了干旱、鹽堿、高溫等極端的生境，同時也逐漸形成了復雜而有序的多種抗逆機制。MYB類轉(zhuǎn)錄因子參與了許多非生物及生物脅迫的應答過程。擬南芥AtMYB7負調(diào)控ABA信號通路中抑制萌發(fā)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ABI5的表達，從而影響ABA和鹽脅迫下種子的萌發(fā)，與野生型相比，突變體atmyb7在種子萌發(fā)時對ABA和高鹽脅迫更敏感[8]。AtMYB73受鹽脅迫的誘導，敲除突變體atmyb73更耐鹽，且SOS1、SOS3的表達量升高[9]。大豆(Glycinemax)GmMYBJ1基因的表達受到干旱、冷、鹽及ABA的誘導，在擬南芥中過表達GmMYBJ1能提高轉(zhuǎn)基因植物對于干旱和冷的耐受力[10]。GmMYB84受干旱、鹽、過氧脅迫等的誘導，其過表達株系在干旱處理下的存活率高于野生型[11]。蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)MtMYB3能直接結(jié)合到MtCBF4的啟動子區(qū)域，在正常條件下抑制其表達，而受冷誘導的轉(zhuǎn)錄因子MtMYB61則在冷脅迫下會與MtMYB3的DNA結(jié)合區(qū)互作，解除MtMYB3對MtCBF4基因的抑制從而調(diào)控植物對于冷脅迫的應答[12]。小麥(TriticumaestivumL.)TaPIMP1響應多種非生物脅迫，過表達TaPIMP1基因使小麥更能抵抗小麥根腐病(Bipolarissorokiniana)的侵害并對干旱脅迫表現(xiàn)出更好的耐受性，而且RD22、TLP4和PR1a等與ABA、水楊酸調(diào)控有關(guān)的基因表達上調(diào)，TaPIMP1抑制表達株系表現(xiàn)出對脅迫更敏感的表型[13]。

中間錦雞兒(Caraganaintermedia)俗稱“檸條”，是豆科錦雞兒屬(Caragana)植物，多年生灌木[14]。檸條根系發(fā)達，能適應干旱、鹽堿等環(huán)境，在降水稀少、土壤貧瘠的惡劣條件容易存活，對維持良好的生態(tài)環(huán)境起到重要的作用[15]。檸條作為飼用料用、造紙和板材原料、防風固沙、綠化環(huán)境、保持水土、改善西部地區(qū)荒漠化現(xiàn)狀的優(yōu)良候選樹種，在我國干旱及半干旱地區(qū)被廣泛種植[16]。本研究從中間錦雞兒干旱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中克隆了兩個R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，并分析了逆境脅迫下基因的表達水平，構(gòu)建了過表達載體并轉(zhuǎn)化野生型擬南芥以探究基因功能，推測其與中間錦雞兒響應非生物脅迫的機制有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

擬南芥Columbia生態(tài)型(Col-0)由本實驗室提供，中間錦雞兒種子采自于內(nèi)蒙古烏蘭察布市四子王旗。利用70%、100%乙醇對擬南芥種子進行滅菌，晾干后加入無菌水。4 ℃避光放置3 d，種于營養(yǎng)土和蛭石(m(營養(yǎng)土)∶m(蛭石)=1∶3)的培養(yǎng)缽中用于后續(xù)實驗，中間錦雞兒種子可不經(jīng)滅菌、低溫處理，直接播種。植物培養(yǎng)條件為22 ℃、16 h光照/8 h黑暗、7 000～8 000 lx光照強度。

向正常生長25 d左右的中間錦雞兒幼苗培養(yǎng)盤中澆入300 mmol/L的NaCl溶液進行鹽脅迫。在處理0、0.5、1、3、6、9、12、24、48 h時取樣。取生長20 d的幼苗進行干旱處理，取樣時間為0、4、8、9、10、11、12 d，復水3 d后最后1次取樣。

1.2 總RNA和DNA提取

采用TRIzol(Invitrogen)法提取總RNA；CTAB法進行DNA的提取[17]。利用Quawell公司的超微量紫外分光光度計Q5000對DNA和總RNA進行定量。通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行RNA質(zhì)量的檢測。

1.3 反轉(zhuǎn)錄與基因克隆

取1 000 ng經(jīng)過純化的中間錦雞兒總RNA或500 ng擬南芥總RNA，利用TaKaRa公司的RTase M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，依照反轉(zhuǎn)錄試劑說明書進行cDNA第一條鏈的合成。

根據(jù)中間錦雞兒干旱轉(zhuǎn)錄組庫中查找的CiMYB74和CiMYB116基因序列，利用Primer premier5.0軟件設計特異性引物(表1)，以cDNA第一條鏈進行cDNA的克隆，中間錦雞兒基因組DNA為模板進行g(shù)DNA的克隆?；驍U增所用的Primer STAR高保真酶、LATaq酶、rTaq酶及電泳所用Marker DL5000、1 kb DNA ladder購自于TaKaRa(大連寶生物工程有限公司)。PCR反應體系：5×Primer STAR buffer(+Mg2+)10 μL，上游(CiMYB74-5′或CiMYB116-5′)和下游(CiMYB74-3′或CiMYB116-3′)引物各2 μL(10 μmol/L)，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，模板1 μL，Primer STAR酶0.5 μL，無菌水30.5 μL。反應程序參照Primer STAR說明書(TaKaRa，Cat#DR010S)，CiMYB74和CiMYB116引物退火溫度分別為61 ℃和59 ℃。擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序，試驗所用引物均合成于此公司。

1.4 CiMYB74基因啟動子的擴增及元件分析

通過染色體步移的方法獲取基因的啟動子序列。根據(jù)CiMYB74和CiMYB116基因gDNA序列，設計3條同向(Anti-sense)且退火溫度較高(65～70 ℃)的特異性引物，分別為SP1、SP2、SP3(表1)，與試劑盒中經(jīng)過獨特設計的退火溫度較低的4種簡并引物(AP1、AP2、AP3、AP4)進行熱不對稱性PCR反應，經(jīng)過3輪巢式PCR即可獲得已知序列的側(cè)翼序列。具體反應依照Genome Walking Kit試劑盒(TaKaRa，Cat#6108)說明書[18]。

表1 試驗所用到的引物

注：引物序列中的小寫字母表示與線性化載體互補的接頭序列。

1.5 CiMYB74過表達重組載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植物純合體篩選鑒定

根據(jù)CiMYB74基因的ORF序列設計特異性引物CiMYB74-HA5′和CiMYB74-HA3′，利用Primer STAR高保真酶擴增ORF區(qū)域，反應體系同前面擴增gDNA一樣。通過In-Fusion(TaKaRa)連接酶將擴增片段連入線性化的pCanG-HA表達載體中，重組載體中目的基因的兩端分別有SalI、SacI酶切位點，SalI、SacI雙酶切后，如果得到單一的符合預期大小的目的基因條帶，則證明過表達載體構(gòu)建成功。在pCanG-HA載體上有3個PstI位點，如果PstI單酶切后得到3條符合預期大小的條帶，則證明實驗所用載體不存在問題。測序正確的重組質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化法導入農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞GV3101中。通過浸花法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥并篩選純合體植株，具體操作參考于[15]等的方法。通過RT-PCR或?qū)崟r熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因擬南芥中CiMYB74基因表達情況。

1.6 萌發(fā)率試驗

將CiMYB74過表達株系和野生型擬南芥種子分別點種在含有100、150、200 mmol/L NaCl以及不含NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上，以胚根突破種皮為萌發(fā)標志，每天統(tǒng)計各平板的萌發(fā)情況。由于100 mmol/L平板上種子萌發(fā)整體較快，在第4天進行拍照；150、200 mmol/L的NaCl平板在萌發(fā)第8天拍照。

1.7 基因數(shù)據(jù)分析

在NCBI BLAST網(wǎng)站中(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行基因相近序列搜索，應用Vector NTI Advance@ 11.5進行序列拼接，ClustalW進行序列比對，MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用DNAMAN多序列比對查找內(nèi)含子與外顯子，ExPASy網(wǎng)站ProParam工具(http://web.expasy.org/protparam/)推導氨基酸序列理論等電點與分子量，ProtScale工具(http://web.expasy.org/protscale/)進行蛋白質(zhì)疏水性分析。通過NPS@網(wǎng)站HNN工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html)預測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。通過PlantCARE網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對基因啟動子序列進行在線分析，尋找可能的順式作用元件。

2 結(jié)果與分析

2.1 CiMYB74和CiMYB116基因克隆和序列分析

利用特異性引物擴增CiMYB74和CiMYB116的包含編碼區(qū)的cDNA及gDNA序列。CiMYB74基因PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳得到約1 000和2 000 bp的條帶(圖1A，B)，CiMYB116檢測到約1 000和1 200 bp的條帶(圖1C，D)。

序列分析表明CiMYB74基因gDNA序列長度為1 976 bp，包含3個外顯子區(qū)(1～140，250～367，1 266～1 976 bp)和2個內(nèi)含子區(qū)(141～249，368～1 265 bp)；ORF長度為978 bp，編碼326個氨基酸，起始密碼子ATG，終止密碼子TAA(圖2)。CiMYB116基因ORF長900 bp，編碼300個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA；gDNA長為1 270 bp，包含3個外顯子(144、129、624 bp)和兩個內(nèi)含子(96、277 bp)(圖3)。

1.CiMYB74基因cDNA擴增結(jié)果；2.CiMYB74基因gDNA擴增結(jié)果；3.CiMYB116基因cDNA擴增結(jié)果；4.CiMYB116基因gDNA擴增結(jié)果；M為DL5000。

圖1CiMYB74和CiMYB116基因克隆

下劃線標注部分表示內(nèi)含子區(qū)域。

下劃線標注部分表示內(nèi)含子區(qū)域。

2.2 蛋白理化性質(zhì)預測

CiMYB74和CiMYB116基因編碼蛋白的理論等電點分別是6.1和6.72，預測分子質(zhì)量為36.65和34.48 ku。對氨基酸序列進行親疏水性分析，其中：CiMYB74蛋白第301位的谷氨酸(Glu)親水性最強(具最低分值-2.7)，第174和175位的丙氨酸(Ala)、蘇氨酸(Thr)疏水性最強(同時具有最高分值1.622)；CiMYB116第137位的丙氨酸(Ala)疏水性最強(具最高分值1.144)，154位的絲氨酸(Ser)親水性最強(具最低分值，-2.467)。兩條多肽鏈中親水性氨基酸分布較多，表明這兩個蛋白整體上是親水的。預測了CiMYB74和CiMYB116蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明無規(guī)則卷曲、α螺旋與β折疊這3種主要的二級結(jié)構(gòu)均存在于這兩個蛋白中，而且均以無規(guī)則卷曲最多，CiMYB74蛋白質(zhì)中的β折疊(9.51%)所占比例要高于CiMYB116蛋白(6.33%)，而α螺旋和無規(guī)則卷曲比例低于CiMYB116蛋白(表2)。

表2 CiMYB74和CiMYB116蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)

2.3 CiMYB74和CiMYB116基因的同源性及進化分析

根據(jù)CiMYB74和CiMYB116推導的氨基酸序列，在NCBI Blast中檢索與其最相近的序列并進行多序列比對分析。結(jié)果顯示CiMYB74和CiMYB116都是典型的R2R3類MYB轉(zhuǎn)錄因子，CiMYB74第16位到第64位氨基酸為R2結(jié)構(gòu)域，第67到第115位氨基酸為R3結(jié)構(gòu)域(圖4)。CiMYB116第18位到第68位氨基酸為R2結(jié)構(gòu)域，第71到第119位氨基酸為R3結(jié)構(gòu)域；與野生大豆(Glycinesoja)GsMYB21(KHN11407.1)和大豆GmMYB340(XP_003555909.1)的相似度均為77%(圖4)。

從Genebank中下載與CiMYB74、CiMYB116氨基酸序列相似的其他物種的序列，經(jīng)ClustalW比對，利用MEGA5軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。聚類結(jié)果表明CiMYB74與豆科植物的一些MYB轉(zhuǎn)錄因子親緣關(guān)系都很近，與鷹嘴豆(Cicerarietinum)CaMYB308-like、大豆GmMYB330-like等相似度都達到70%以上，而與非豆科植物，如葡萄VvMYB39等親緣關(guān)系相對較遠(圖5)。擬南芥AtMYB41、AtMYB74及AtMYB102屬于R2R3-MYB家族第11亞組，該亞組成員在R3結(jié)構(gòu)域后通常包含PRLLLD基序，CiMYB74也含有PRLLLD序列(圖4和圖5)[1]。

黑色實線和虛線分別代表R2和MYB R3結(jié)構(gòu)域，黑色方框圈出了同一亞組的保守基序。

采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；Bootstrap設置為1 000次。

CiMYB116與擬南芥MYB家族中的AtMYB116的親緣關(guān)系最近，相似度達到48%。AtMYB116屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子第20亞組，該亞組成員在R3結(jié)構(gòu)域后所共有的保守序列是WxPRL，CiMYB116同樣含有這一序列(圖4和圖5)。與第11亞組其他成員相比，CiMYB74與擬南芥R2R3-MYB的其他亞組成員距離相對更遠；CiMYB116則與除第20亞組外的成員親緣關(guān)系更遠(圖6)。

1，5.第一輪延伸的擴增產(chǎn)物；2，6.第二輪延伸的擴增產(chǎn)物；3、4和7、8.第三輪延伸的擴增產(chǎn)物；M1.DL5000，M2.1kb分子質(zhì)量標準。

2.4 NaCl和干旱脅迫下基因的表達

qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，CiMYB74和CiMYB116基因轉(zhuǎn)錄水平的表達都受到干旱和NaCl脅迫的誘導(表3)。CiMYB74在干旱脅迫第11天時表達量達到最高值，約為處理前的230倍；CiMYB116基因的表達水平受干旱脅迫誘導呈持續(xù)上升趨勢，并在復水后下降，說明該基因的表達確實受到干旱脅迫的誘導。

表3 干旱與NaCl脅迫下CiMYB74和CiMYB116的基因表達

脅迫CiMYB74處理時間/h基因表達倍數(shù)誤差CiMYB116處理時間/h基因表達倍數(shù)誤差NaCl01.0000 1.0000.51.1010.2410.50.8000.2341.01.6870.5041.03.0390.4883.01.6280.3673.029.7202.8706.03.2470.6559.037.0402.1479.012.2502.36524.035.6304.17024.028.3605.43548.0138.70020.690

NaCl誘導24 h時，CiMYB74基因的表達量是未處理時的36倍多；CiMYB116基因在鹽脅迫48 h后，表達量上調(diào)至處理前的12倍左右。

2.5 CiMYB74和CiMYB116基因啟動子的克隆與序列分析

利用染色體步移試劑盒，以中間錦雞兒gDNA為模板，克隆基因啟動子。測序結(jié)果表明，特異性引物分別與AP3、AP2配對，成功克隆到CiMYB74和CiMYB116基因起始密碼子上游516和1 040 bp的啟動子序列(圖7)。

將獲得的序列輸入到啟動子分析網(wǎng)站PlantCARE中，尋找可能存在的順式作用元件。預測發(fā)現(xiàn)，CiMYB74基因啟動子序列中除了具有啟動子轉(zhuǎn)錄基本核心元件CAAT-box和TATA-box外，還含有多個光應答元件，如G-box(CACGTC)、Gap-box(AAATGGAGA)、MNF1(GTGCCCA/T)等；此外，CiMYB74啟動子還包含生長素響應元件AuxRR-core(GGTCCAT)和TGA-element(AACGAC)、茉莉酸響應基序CGTCA-motif和TGACG-motif、ABA及病毒應答元件CE3(GACGCGTGTC)、厭氧誘導響應元件ARE(TGGTTT)以及響應晝夜節(jié)律振蕩元件Circadian(CAANNNNATC)等(表4)。啟動子順式作用元件預測結(jié)果初步表明，CiMYB74基因可能參與非生物脅迫應答及調(diào)控植物的某些生長發(fā)育過程。

表4 CiMYB74啟動子分析預測

CiMYB116啟動子序列中包含有與非生物脅迫有關(guān)的順式作用元件，如熱激應答元件(HSE，heat shock element)、水楊酸應答元件(TCA-element)、參與防衛(wèi)反應與脅迫應答基序(TC-rich repeat)以及響應節(jié)律振蕩元件(Circadian)(表5)。除此之外，與光應答有關(guān)的元件也較多出現(xiàn)在CiMYB116啟動子序列中，如Box-4，MRE(MYB binding site involved in light)，LAMP-element以及ATC-motif。

A.pCanG-CiMYB74表達載體的酶切驗證：1.對照質(zhì)粒；2.SalI、SacI酶切鑒定；3.PstI酶切鑒定；B.CiMYB74過表達株系的RT-PCR鑒定：Control+.檸條cDNA做模板的陽性對照；Control-.擬南芥cDNA做模板的陰性對照；其他數(shù)字表示過表達株系)；C.CiMYB74過表達株系的qRT-PCR鑒定(選擇AtEF1α作為內(nèi)參基因。結(jié)果計算采用2-ΔCT法?？v軸用對數(shù)軸表示)；M1.1kb分子量標準；M2.DL5000 Marker。

圖7 pCanG-CiMYB74重組質(zhì)粒的構(gòu)建及過表達植物的鑒定

2.6 pCanG-CiMYB74重組表達載體的構(gòu)建及純合體植株的鑒定

利用In-Fusion酶將CiMYB74基因ORF區(qū)連入pCanG載體中，使用SalI、SacI進行雙酶切，PstI單酶切驗證重組質(zhì)粒(圖8A)。通過RT-PCR檢測了轉(zhuǎn)基因植物中CiMYB74的表達情況，由圖可知，在10個轉(zhuǎn)CiMYB74基因的純合體株系和陽性對照(C+)中均擴增出目的基因，而陰性對照(C-)中并未有目的條帶出現(xiàn)(圖8B)。過表達植物生長過程中呈現(xiàn)的形態(tài)與野生型沒有明顯區(qū)別，根據(jù)熒光定量PCR檢測結(jié)果，選取表達量最高、最低以及居中的3個過表達株系用于后續(xù)實驗，即OE-1、OE-2和OE-6(圖8)。

2.7 CiMYB74負調(diào)控種子萌發(fā)時對鹽脅迫的響應

脅迫表達分析結(jié)果表明，CiMYB74基因的表達受到NaCl的誘導，而且很多MYB轉(zhuǎn)錄因子也參與植物對鹽脅迫的響應過程。為了進一步了解在擬南芥中過表達中間錦雞兒CiMYB74是否能改變擬南芥對NaCl的敏感性，分別檢測了在含有100、150和200 mmol/L NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上野生型和轉(zhuǎn)基因株系種子的萌發(fā)情況。萌發(fā)實驗顯示，在含有NaCl的培養(yǎng)基上，過表達株系的萌發(fā)表現(xiàn)出對NaCl更不耐受的表型。其中，在含有200 mmol/L NaCl的培養(yǎng)基上，CiMYB74轉(zhuǎn)基因株系的萌發(fā)被強烈地抑制(圖8)。這些結(jié)果說明，CiMYB74負調(diào)控種子萌發(fā)時期對于鹽脅迫的應答過程。

3 結(jié)論和討論

本研究從中間錦雞兒干旱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中克隆了兩個R2R3-MYB基因，分別命名為CiMYB74和CiMYB116。CiMYB74和CiMYB116基因gDNA長度分別為1 976和1 270 bp，均包含3個外顯子和2個內(nèi)含子；開放閱讀框(ORF)長度分別為978和900 bp，分別編碼326和300個氨基酸。CiMYB74和CiMYB116基因的表達都受到鹽和干旱脅迫的誘導。此外，克隆得到516 bp的CiMYB74啟動子序列，主要包含茉莉酸響應基序(CGTCA-motif和TGACG-motif)、ABA及病毒應答元件(CE3)、厭氧誘導響應元件(ARE)以及響應節(jié)律振蕩元件(Circadian)等；克隆得到1040bp的CiMYB116啟動子序列，主要包含熱應答元件、水楊酸應答元件、防衛(wèi)反應及脅迫應答元件。最后，在擬南芥中過表達CiMYB74，轉(zhuǎn)基因株系種子在萌發(fā)時期對鹽脅迫更加敏感，表明該基因負調(diào)控種子萌發(fā)時期對于鹽脅迫的耐受能力。

系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)CiMYB74基因與R2R3-MYB第11亞組的AtMYB74、AtMYB102和AtMYB41的親緣關(guān)系較近。已有研究表明，擬南芥第11亞組成員之間功能差異較大，成員所共有的PRLLLD序列和基因功能間沒有明確的關(guān)聯(lián)[19]。擬南芥AtMYB74受鹽脅迫誘導且通過啟動子區(qū)DNA甲基化的方式負調(diào)控植物響應鹽脅迫的過程；與野生型相比，AtMYB74過表達株系種子在萌發(fā)時期表現(xiàn)出對鹽更敏感的表型，但是在含有NaCl的土壤中野生型和過表達的幼苗沒有表現(xiàn)出明顯的差別[19]。與AtMYB74不同，擬南芥AtMYB102受生物脅迫的誘導，在菜粉蝶(Pierisrapae)咬食的組織中AtMYB102表達量明顯上調(diào)[20]。其突變體myb102比野生型更加不抗蟲且相關(guān)防御基因表達降低，而過表達株系則更加抗蟲[20]。第11亞組另一個成員AtMYB41同樣也響應各種非生物脅迫，對AtMYB41過表達植物進行的轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析數(shù)據(jù)表明，AtMYB41通過控制初級代謝及負調(diào)控植物對于滲透脅迫的短期轉(zhuǎn)錄水平上的響應來參與多種細胞進程[21]。此外，另有研究表明AtMYB41可起始擬南芥木栓質(zhì)合成過程中的必須步驟，AtMYB41過表達后可促進木栓質(zhì)合成相關(guān)基因CYP86A1和CYP86B1的表達而增加植物體內(nèi)木栓質(zhì)的積累[22]。我們的研究表明CiMYB74的表達受NaCl和干旱的誘導，而且在擬南芥中過表達CiMYB74會增強植物在種子萌發(fā)時期對鹽的敏感性，這一結(jié)果與AtMYB74過表達后產(chǎn)生的表型基本一致[19]。分析CiMYB74啟動子序列后發(fā)現(xiàn)，有生長素響應元件、厭氧誘導元件、茉莉酸響應元件等順式作用元件出現(xiàn)，這預示著CiMYB74除了響應鹽脅迫外，可能還參與了植物體內(nèi)其他的一些生理生化過程。

此外，系統(tǒng)進化分析還表明擬南芥中與CiMYB116親緣關(guān)系較近的有AtMYB116、AtMYB21、AtMYB112、AtMYB78和AtMYB108，其中AtMYB21屬于第19亞組，其他幾個成員屬于第20亞組[6]。Mengiste等對擬南芥幾乎所有MYB做了響應CdCl2、NaCl及各種激素處理的表達檢測，其中AtMYB116、AtMYB21、AtMYB112、AtMYB78和AtMYB108基因?qū)@些處理都有不同程度的響應[23]。AtMYB108對于擬南芥響應非生物脅迫是必須的，其突變體植株比野生型更不耐鹽，干旱處理下突變體株系的存活率低于野生型[23]。Cheng等的研究表明，赤霉素和茉莉酸共同作用能影響AtMYB21、AtMYB24和AtMYB57的表達，從而促進植物雄蕊敗育[24]。AtMYB112在鹽脅迫和強光照下促進花青素的合成，AtMYB112基因受NaCl脅迫誘導后表達量上升[25]。棉花GhMYB108通過和類鈣調(diào)素蛋白GhCML11互作使植物應對真菌脅迫，GhMYB108基因敲除突變體對輪枝菌敏感性增強，而過表達株系則表現(xiàn)出對該菌種更耐受的表型[26]。本研究中的CiMYB116基因在干旱及鹽脅迫后，表達量都有不同程度的上調(diào)。此外，通過對克隆得到的CiMYB116基因啟動子序列分析表明，該基因啟動子區(qū)域包含一些非生物脅迫和生物脅迫相關(guān)的順式作用元件，如熱激應答元件(HSE)、水楊酸應答元件(TCA-element)、參與防衛(wèi)反應與脅迫應答基序(TC-rich repeat)，說明CiMYB116基因可能參與了中間錦雞兒抵御環(huán)境脅迫和病原菌的信號調(diào)控。與CiMYB116親緣關(guān)系相近的擬南芥MYB的功能集中在抵抗非生物或生物脅迫及植物發(fā)育調(diào)控，但是R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子在不同物種中功能差別很大。CiMYB116的功能可能與擬南芥AtMYB21、AtMYB116或AtMYB108有所不同，具體的生物學功能還需進一步的驗證。植物存在于自然界中，不能像動物一樣主動躲避各種極端環(huán)境及生物脅迫，但是在長期的進化過程中，也具備了響應各種非生物脅迫的應答機制。中間錦雞兒作為西北部干旱、半干旱地區(qū)優(yōu)秀的造林樹種，在多種逆境脅迫下均能生存。從中間錦雞兒中尋找植物響應干旱、鹽堿及冷凍害等非生物脅迫的基因及其調(diào)控機制，有助于深入了解植物應答逆境脅迫的分子機理。