馮延芝 常德龍 王保平 于自力 趙陽 喬杰 王璐

(國家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心，鄭州，450003) (河南省國有孟州林場) (國家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心)

ω-3脂肪酸是人體不能自身合成的必需脂肪酸，主要包括十八碳三烯酸(α-亞麻酸)、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，它具有促進(jìn)大腦的發(fā)育(嬰幼兒)、維持視力和免疫系統(tǒng)、調(diào)節(jié)血脂和血栓、降低心臟病風(fēng)險以及抑制衰老等重要作用[1-4]。ω-3脂肪酸脫氫酶主要有FAD3、FAD7、FAD8三種，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的FAD3僅催化亞油酸合成α-亞麻酸；位于質(zhì)體中的FAD7和FAD8不僅可催化亞油酸合成α-亞麻酸，還可催化十六碳二烯酸合成十六碳三烯酸；這三種催化合成α-亞麻酸的關(guān)鍵酶，可直接影響ω-3脂肪酸的含量高低[5-7]。

研究表明，植物種子中的α-亞麻酸主要是由FAD3催化合成的[8]。目前，F(xiàn)AD3基因已從紫蘇(Perillafrutescens)[2]、紅花(Carthamustinctorius)[9]、花生(Arachishypogaea)[1]、牡丹(Paeoniasuffruticosa)[10]、亞麻薺(Camelinasativa)[11]、亞麻(Linumusitatissimum)[12]、毛白楊(Populustomentosa)[13]、麻瘋樹(Jatrophacurcas)[14]等多種植物中克隆得到。已有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入大豆FAD3基因的水稻種子中，α-亞麻酸的量提高了10倍[15]；FAD3基因沉默后的煙草突變株中，α-亞麻酸的含量顯著少于野生型煙草[16]；FAD3基因的過量表達(dá)，可提高番茄幼苗的耐鹽脅迫能力[17]。上述研究表明，F(xiàn)AD3基因不僅可提高植物體內(nèi)α-亞麻酸的含量，并可改良植物對非生物逆境脅迫的適應(yīng)性[18-19]。

目前，雖對不同植物中FAD3的結(jié)構(gòu)、功能等研究較多，但對不同生物體中FAD3蛋白的系統(tǒng)整理和綜合比較分析較少。為此，本研究收集整理了31個生物體中35個FAD3蛋白的相關(guān)序列，并對其理化性質(zhì)分析、多重序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化等進(jìn)行了綜合比較分析，為更深入研究植物體內(nèi)α-亞麻酸合成、積累的調(diào)控機理以及定向遺傳改良等提供參考。

1 材料與方法

FAD3是植物脂肪酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，主要催化亞油酸轉(zhuǎn)化為亞麻酸，它首先在擬南芥突變體中發(fā)現(xiàn)[20]。本研究使用35個FAD3全長蛋白是利用擬南芥(Arabidopsisthaliana)FAD3的序列(登錄號：NM_128552.4)，在NCBI的數(shù)據(jù)庫中比對、檢索到的，共來自31個生物體。本文中分析使用的FAD3蛋白名稱、對應(yīng)的物種以及GenBank登錄號等詳見表1。FAD3蛋白的簡稱，由植物拉丁名的首字母、GenBank中FAD3蛋白名稱和登錄號組成。

表1 FAD3蛋白的相關(guān)信息

注：Ⅰ為雙子葉植物，Ⅱ為單子葉植物，Ⅲ為真菌。

利用網(wǎng)站ExPASy中的ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam)，對35個FAD3蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)量、相對分子質(zhì)量、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)、酸(堿)性氨基酸殘基等特性進(jìn)行綜合分析，后期利用Microsoft Excel完成數(shù)據(jù)處理。

利用軟件Vector NTI Advance 11(Invitrogen)中AlignX程序的ClustalW算法，對35個FAD3蛋白質(zhì)進(jìn)行多重序列比對；該方法是依據(jù)氨基酸殘基序列的相似性程度確定分?jǐn)?shù)，相關(guān)參數(shù)均為軟件默認(rèn)值。

以熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)作為外類群。首先利用MEGA 6.0軟件中的Align對35個FAD3全長蛋白序列重新進(jìn)行多序列比對；然后將比對結(jié)果兩端的部分空白刪除整齊備用；再使用MEGA 6.0軟件Phylogeny中的鄰接法(Neighbor-Joining)，構(gòu)建35個FAD3全長蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。相關(guān)參數(shù)均為軟件默認(rèn)值，置信度用自舉檢驗法檢驗，共設(shè)置1 000次循環(huán)，節(jié)點處的數(shù)字表示bootstrap值在1 000個循環(huán)中所占的百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 FAD3蛋白的理化性質(zhì)

利用ExPASy網(wǎng)站的ProtParam tool對35個FAD3蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析。結(jié)果表明：不同植物中FAD3蛋白質(zhì)的氨基酸序列差異不大，35個FAD3蛋白的平均長度為393±22個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量為45 047±2 259，理論等電點為8.09±0.78；FAD3蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)為33.31±4.33，除油桐(Verniciafordii)和小麥(Triticumaestivum)外，其它33個FAD3蛋白均穩(wěn)定；FAD3蛋白質(zhì)的親水性指數(shù)為-0.15±0.06，屬于親水性蛋白，并含有(8.51±0.69)%的酸性氨基酸殘基、(9.10±0.70)%的堿性氨基酸殘基。

2.2 FAD3蛋白的多序列比對

利用Vector NTI Advance 11多序列比對軟件，對35個FAD3蛋白進(jìn)行多序列比對分析(見圖1)。由圖1可見：無論是單子葉植物還是雙子葉植物，其FAD3蛋白序列間均具有一定的保守性，其相似性達(dá)66.6%。其中，亞麻(Linumusitatissimum)[12]、播娘蒿(Descurainiasophia)[21]、紫蘇(Perillafrutescens)[22]等α-亞麻酸含量較高的植物中，F(xiàn)AD3蛋白的相似性較高(達(dá)85.8%)；而擬南芥(Arabidopsisthaliana)[22]、油桐(Verniciafordii)[23]、白芥子(Sinapisalba)[24]等α-亞麻酸含量稍低的植物中，F(xiàn)AD3蛋白的相似性也較高(達(dá)97.4%)。初步推測，F(xiàn)AD3蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)與其α-亞麻酸的含量關(guān)系密切。

第一行數(shù)字表示多序列比對的位點，背景顏色表示不同保守程度的氨基酸殘基，其中保守性最高的是黃色，其次是藍(lán)色、綠色，白色的保守性最低。

通過比對分析發(fā)現(xiàn)，35個蛋白序列中存在44個完全保守區(qū)域，共包含4種類型。除外類群CtFAD3-HM214545.1外，其它來自植物體的34個FAD3蛋白質(zhì)中存在64個完全保守區(qū)域，包含7種類型，相似性達(dá)到71.9%；另外，還存在其它保守的氨基酸富集區(qū)，比如HH、PPF、YYR、VLGHDCGHGSFS等。由此可見，不同植物中FAD3蛋白在結(jié)構(gòu)上具有一定的保守性(見表2)。

表2 FAD3蛋白質(zhì)序列保守區(qū)及主要類型

注：CtFAD3-HM214545.1為熱帶假絲酵母的FAD3蛋白質(zhì)，其它34個FAD3蛋白質(zhì)所屬的物種均為植物界。

2.3 FAD3蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化

以熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)作為外類群，利用MEGA 6.0軟件的鄰接法構(gòu)建35個FAD3蛋白質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育樹，所有參數(shù)均為軟件默認(rèn)值(見圖2)。由圖2可見：31個生物體的FAD3蛋白可分為3組，2種單子葉植物(小麥和水稻)單獨聚為1組，其它32個來自雙子葉植物的FAD3蛋白聚為1組，外類群熱帶假絲酵母單獨為1組。單子葉植物與雙子葉植物匯聚后，與外類群熱帶假絲酵母聚在同一進(jìn)化樹中。單子葉植物間的相似性為84.2%，雙子葉植物間相似性為72.7%。大豆(Glycinemax)中3個FAD3蛋白的相似性雖高(98.2%)，但FAD3C并未與FAD3A、FAD3B聚為1支；杜仲(Eucommiaulmoides)、雷氏藻(Physariafendleri)中，2個FAD3蛋白的相似性分別為69.6%、85.8%，也未聚在一起。推測，植物中FAD3雖存在多拷貝的形式，但是其遺傳距離和功能可能并不完全相同。

圖2 不同物種FAD3蛋白質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育

3 結(jié)論與討論

本研究利用擬南芥FAD3蛋白序列(登錄號：NM_128552.4)在NCBI上比對、搜索，獲得31個生物體的35個FAD3全長蛋白，并對其進(jìn)行了理化性質(zhì)分析，其平均長度為393±22個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量為45 047±2 259，理論等電點為8.15±0.76，F(xiàn)AD3屬于親水性蛋白，除油桐(Verniciafordii)和小麥(Triticumaestivum)外，其它33個FAD3蛋白均穩(wěn)定；多重序列比對分析結(jié)果表明，除外類群CtFAD3-HM214545.1外，其它來自植物體的34個FAD3蛋白的相似性達(dá)71.9%，并具有64個完全保守區(qū)域，包括HH、PPF、YYR和VLGHDCGHGSFS等多個保守的氨基酸富集區(qū)；系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果表明，單子葉植物與雙子葉植物雖均處在同一進(jìn)化樹中，但分界明顯，且各聚為1支。

FAD3基因的表達(dá)具有時空性。FAD3基因在油用牡丹種子的不同發(fā)育過程中均有表達(dá)，但差異較大，在結(jié)實期10 d幼種中的表達(dá)量最高，20d次之[10]，F(xiàn)AD3基因在亞麻薺發(fā)育的種子中高水平表達(dá)[11]，F(xiàn)AD3基因在紫蘇種子中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于根、莖、葉和花等其它組織器官[22]，預(yù)示著ω-3脂肪酸脫氫酶FAD3在上述植物種子α-亞麻酸合成和積累中發(fā)揮重要功能。植物體內(nèi)α-亞麻酸含量的高低，不僅與FAD3基因的表達(dá)量有關(guān)，還與FAD3基因的拷貝數(shù)關(guān)系密切。研究表明，在富含α-亞麻酸的紫蘇(Perillafrutescens)、杜仲(Eucommiaulmoides)、亞麻(Linumusitatissimum)等植物中，F(xiàn)AD3基因均存在多拷貝的形式[8，25-26]，而在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、小麥(Triticumaestivum)、水稻(Oryzasativa)等α-亞麻酸含量較低的植物中均為單拷貝[9]，M. Venegas-Calerón et al.[27]在向日葵中未分離到FAD3基因，推測其種子中微量的α-亞麻酸是由FAD7催化合成的。

Puttick et al.[28]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)FAD3基因，可使擬南芥種子中的α-亞麻酸含量由19%提高到39.6%；異位表達(dá)擬南芥FAD3基因也可提高大豆種子中α-亞麻酸的含量[29-30]；轉(zhuǎn)入FAD3基因的煙草，不僅α-亞麻酸含量明顯增加，且大大提高了對寒冷的耐受能力[31]；Zhou et al.[19]在白楊中過表達(dá)FAD3基因，其抗寒性得到顯著提高；FAD3基因的過表達(dá)可顯著提高番茄的耐寒和耐鹽能力[17，32]。綜上所述，通過遺傳修飾上調(diào)FAD3基因的表達(dá)和酶活性，不僅可促進(jìn)α-亞麻酸的富集，還可通過調(diào)節(jié)不飽和脂肪酸的含量改良植物對溫度、鹽害等逆境脅迫的適應(yīng)性。植物體內(nèi)ω-3脂肪酸脫氫酶FAD3的活性，除受到自身FAD3基因的表達(dá)調(diào)控外，還與其上下游基因間的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控、外界環(huán)境因子以及底物含量等之間的關(guān)系還有待于進(jìn)一步深入探究。