段肖肖 余振強(qiáng) 臧丹丹 張丹丹 陳韻如 王衷涵 牛亦龍 王玉成

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

檉柳，屬檉柳科檉柳屬灌木或小喬木，在水土保持和固沙方面有一定優(yōu)勢，是有著極強(qiáng)適應(yīng)逆境能力的樹種，因此常被種植于干旱、鹽漬地區(qū)[1]。鋅指蛋白(ZFP)是一類通過結(jié)合鋅離子折疊成手指狀結(jié)構(gòu)域(鋅指結(jié)構(gòu)域)的蛋白。鋅指結(jié)構(gòu)域主要由半胱氨酸(Cys)和組氨酸(His)組成。根據(jù)在手指的二級結(jié)構(gòu)中C和H殘基的數(shù)量和順序(C和H分別代表半胱氨酸和組氨酸)的不同，鋅指蛋白被分為9類，包括C2H2、C8、C6、C3HC4、C2HC、C2HC5、C4、C4HC3和CCCH[2-3]。鋅指蛋白可以通過與靶分子DNA、RNA序列特異性結(jié)合[4]，以及與自身或其他鋅指蛋白的結(jié)合[5]，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)控基因的表達(dá)、細(xì)胞分化以及胚胎發(fā)育等。鋅指蛋白在植物的非生物脅迫與植物發(fā)育方面有重要功能。在之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)C3HC4環(huán)形鋅指蛋白ThZFP1能夠響應(yīng)非生物脅迫，其過表達(dá)植株能夠顯著提高植物的抗旱耐鹽能力[6]，這表明ThZFP1在非生物脅迫的傳導(dǎo)途徑中扮演者重要的角色。

轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor,TF)在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是真核基因表達(dá)調(diào)控的主要方式，在細(xì)胞生命過程中發(fā)揮重要作用。轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程以DNA為模板合成RNA，細(xì)胞中具有大量序列特異的DNA結(jié)合蛋白，這些蛋白能準(zhǔn)確地識別并結(jié)合到特異的DNA序列，即DNA和蛋白質(zhì)之間的相互作用。近年來，酵母單雜交技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于克隆和鑒定各種動植物的轉(zhuǎn)錄因子[7-11]。目前一般采用以DNA為中心的方法，即由已知DNA片段確定與之互作的蛋白[12-13]，具有簡單高效的優(yōu)點(diǎn)，可以在體內(nèi)檢測蛋白質(zhì)與DNA的相互作用，但是不能確定與特定的TF結(jié)合的DNA順式作用元件的類型。因此，我們開發(fā)了以轉(zhuǎn)錄因子為中心的酵母單雜交(TF-Centered Y1H)方法[14]，此方法可以揭示TF或TFs所識別的順式作用元件，并將其廣泛應(yīng)用于研究DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。基因槍法是指用鎢粉或金粉包裹外源DNA,而后依靠基因槍裝置,利用高壓氦氣沖擊波加速微彈去穿透植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,使外源DNA進(jìn)入植物細(xì)胞并整合到植物細(xì)胞染色體組中,從而達(dá)到穩(wěn)定遺傳和表達(dá)的目的。

本研究利用以TF為中心的反向Y1H方法，得到ThZFP1蛋白特異性結(jié)合的DOF和ARR1AT順式作用元件，并運(yùn)用基因槍技術(shù)和GUS酶活測定對上述結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，為更深入研究ThZFP1的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

大腸桿菌感受態(tài)DH5α、pCMBIA 1301載體和pGADT7-Rec2載體、pHIS2-DNA隨機(jī)文庫均由本實(shí)驗(yàn)室保存；煙草由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)；In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit、酵母單雜交試劑盒購自Clontech公司；酵母質(zhì)粒提取試劑盒購自北京原平皓生物公司；X-α-Gal、3-AT、氨基酸、PEG3350、DMSO均購自Sigma公司。Kan和Amp購自Sigma公司，其它試劑為國產(chǎn)分析純；DNA合成及測序在上海生工股份有限公司完成。

1.1 構(gòu)建pGADT7-Rec2-ThZFP1載體

以檉柳cDNA為模板，設(shè)計Rec2-ThZFP1-F和Rec2-ThZFP1-R引物(如表1)，將回收的ThZFP1基因片段和單酶切回收的pGADT7-Rec2片段用In-Fusion酶連接，構(gòu)建成pGADT7-Rec2-ThZFP1載體。取上述連接液進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化。菌液涂在含50 mg/L Amp的固體LB培養(yǎng)基上篩選。隨機(jī)挑取篩選培養(yǎng)基上的單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，以Rec2-ThZFP1-F和Rec2-ThZFP1-R為引物，進(jìn)行菌液PCR。將得到的陽性菌株送生工測序，并提取質(zhì)粒。

表1 構(gòu)建pGADT7-Rec2-ThZFP1重組載體的引物序列

1.2 ThZFP1結(jié)合的順式作用元件特異性

pGADT7-Rec2-ThZFP1與pHIS2-DNA隨機(jī)文庫共轉(zhuǎn)化酵母Y187，方法按酵母單雜交試劑盒(Clontech)。挑取SD/-His/-Leu/-Trp+3-AT選擇培養(yǎng)基上的單克隆菌落，提取相應(yīng)酵母單菌落的質(zhì)粒并送上海生工股份有限公司測序。

1.3 識別的順式作用元件與ThZFP1的特異性驗(yàn)證

將得到的識別順式作用元件序列依次進(jìn)行左缺失和右缺失，通過酵母單雜交技術(shù)來確定識別順式作用元件的核心序列。構(gòu)建pHIS2與元件1(簡稱A)、元件2(簡稱B),將pHIS2載體用EcoRI和SacI進(jìn)行雙酶切。將A和B的序列從左邊的序列依次缺失，然后再從右邊的序列依次缺失，用2次重復(fù)的形式串聯(lián)，并在插入序列的兩端分別引入EcoRI和SacI的酶切位點(diǎn)，直接合成兩條互補(bǔ)的寡核苷酸。分別設(shè)計用于構(gòu)建重組報告載體pHIS2-A(左右缺失)和pHIS2-B(左右缺失)的引物。然后，用酵母單雜交技術(shù)研究ThZFP1結(jié)合的元件序列。

表2 構(gòu)建重組報告載體pHIS2-A/B的左右缺失的引物序列

1.4 ThZFP1與其識別的順式作用元件在煙草中的互作驗(yàn)證

將上述研究的元件序列以3次重復(fù)串聯(lián)的方式融合46 bp 35 s小啟動子，所用的引物序列見表3，連接到pCAMBIA1301載體上構(gòu)建報告載體，與pROKII-ThZFP1利用基因槍技術(shù)共同轉(zhuǎn)化到煙草葉片中，測定GUS基因表達(dá)情況。

1.5 GUS酶活的測定

將進(jìn)行基因槍轟擊過的煙草，放在暗處培養(yǎng)48 h后，測定GUS酶活。取上述葉片利用液氮充分研磨，并加入600 μL酶提取液，充分震蕩混勻后，離心后取上清液即為酶液。取50 μL酶液中加入37 ℃預(yù)熱的450 μL MUG檢測液，充分混勻，取50 μL上述混合液與950 μL的Na2CO3混合，并將此時記為0點(diǎn)，以無菌H2O為對照值并調(diào)零，并用同樣的方法在5、10、20、30、45、60 min時間點(diǎn)，用熒光分光光度計測激發(fā)波長365 nm和發(fā)射波長455 nm下的熒光值。

表3 3次重復(fù)串聯(lián)的方式融合46 bp 35 s小啟動子的序列

2 結(jié)果與分析

2.1 檉柳ThZFP1識別的順式作用元件的確定

利用TF-Centered Y1H進(jìn)行確定ThZFP1結(jié)合的元件序列，方法為構(gòu)建pGADT7-Rec2-ThZFP1載體，將其與pHIS2-DNA隨機(jī)文庫共轉(zhuǎn)化酵母Y187，進(jìn)行酵母單雜交，并挑取SD/-His/-Leu/-Trp+3-AT選擇培養(yǎng)基上的陽性克隆菌落，提取相應(yīng)酵母單菌落的質(zhì)粒，陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌體中測序，去除載體序列后，得到與pGADT7-Rec2-ThZFP1重組載體互作的插入序列分別為5’-CCGGAATCGG-3’、5’-AGAAAGAG-3’。

2.2 檉柳ThZFP1識別的順式作用元件的核心序列的確定

為進(jìn)一步確定ThZFP1結(jié)合的核心序列，將獲得的序列依次進(jìn)行左邊界缺失和右邊界缺失，即將5’-CCGGAATCGG-3’、5’-AGAAAGAG-3’序列從左邊的序列依次缺失，然后再從右邊的序列依次缺失，用2次重復(fù)的形式串聯(lián)，通過構(gòu)建pHIS2-A/B重組載體,利用酵母單雜交技術(shù)來確定識別順式作用元件的邊界序列。可以看出，5’-AATCGG-3’可以和ThZFP1互作，而5’-ATCGG-3’不能互作，說明其左邊界為5’-AAT…-3’(圖1)，而5’-CCGGAATCG-3’可以與ThZFP1互作，但5’-CCGGAATC-3’則不能與ThZFP1互作，說明其右邊界序列為5’-…ATCG-3’(圖1)，最后得到5’-CCGGAATCGG-3’插入序列與ThbZIP1互作的核心序列為5’-AATCG-3’。同理，5’-AGAAAGAG-3’插入序列與ThbZIP1互作的核心序列為5’-AAAG-3’(圖2)。經(jīng)過PLACE比對它們分別為ARR1AT和DOF元件。

圖1 元件A(ARR1AT)的核心序列確定

圖2 元件B(DOF)的核心序列確定

2.3 ThZFP1與其識別的順式作用元件在煙草中的互作驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證ThZFP1與這些元件的互作，我們將ARR1AT、DOF元件及部分缺失突變的元件以3次重復(fù)串聯(lián)的方式融合pCAMBIA1301-46bp載體，使元件融合46 bp小啟動子并驅(qū)動GUS，作為reporter載體，將ThZFP1的ORF構(gòu)建到pROK2，使其為35S啟動子驅(qū)動(pROK2-ThZFP1)，作為effector載體，將reporter載體分別與pROK2-ThZFP1報告載體利用基因槍技術(shù)共同轉(zhuǎn)化到煙草葉片中(如圖3)，測定GUS活性，來研究這些元件與ThZFP1的結(jié)合，結(jié)果顯示，這些元件均能與ThZFP1的結(jié)合(如表4)。結(jié)果進(jìn)一步證明，ThZFP1能夠與ARR1AT、DOF元件互作，但不能與突變元件互作，說明它們的互作是特異性的。

圖3 基因槍技術(shù)共同轉(zhuǎn)化到煙草葉片中

元件名稱GUS活性/pmol·mg-1·min-1Contral35.28±2.08ARR1AT26.11±1.11L-ARR1AT5.56±0.83R-ARR1AT4.72±0.42DOF30.83±2.22L-DOF5.56±0.56R-DOF5.83±0.69

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

3 結(jié)論與討論

我們利用TF-Centered Y1H技術(shù)對ThZFP1結(jié)合的DNA序列進(jìn)行了互作的研究。將pGADT7-Rec2-ThZFP1和pHIS2-DNA隨機(jī)文庫同時轉(zhuǎn)入Y187酵母細(xì)胞內(nèi)，并通過TDO+3-AT培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，以研究ThZFP1蛋白與pHIS2-DNA隨機(jī)文庫的互作情況。通過測序結(jié)果比對可知，ThZFP1可以與pHIS2-DNA隨機(jī)文庫中的兩種順式作用元件互作，通過將這兩種順式作用元件依次進(jìn)行左右缺失后，與pGADT7-Rec2-ThZFP1共轉(zhuǎn)化Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，得到這兩種順式作用元件的核心序列，經(jīng)PLACE分析，其分別為ARR1AT、DOF兩種順式作用元件。為了驗(yàn)證我們得到的上述結(jié)論，將ARR1AT、DOF兩種順式作用元件和部分堿基缺失的序列與pCAMBIA1301-46bp小啟動子相連構(gòu)建載體，與pROK2-ThZFP1利用基因槍技術(shù)共同轉(zhuǎn)化到煙草葉片中，測定GUS基因表達(dá)情況，說明ThZFP1蛋白能夠與pHIS2-文庫中的ARR1AT、DOF兩種順式作用元件互作。

以上研究說明，ThZFP1作為一個轉(zhuǎn)錄因子，可以和ARR1AT、DOF兩種順式作用元結(jié)合，并能夠通過與這兩種元件的結(jié)合來調(diào)控基因的表達(dá)，我們以往研究發(fā)現(xiàn)ThZFP1具有抗逆能力[6]，說明，ThZFP1通過與這兩種順式作用元件結(jié)合來調(diào)控基因的表達(dá)，從而調(diào)控一系列抗逆反應(yīng)。