黃國裕，林瑤，林佳浩，陳旭旭，李軍建，朱冠保

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江溫州 325035；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，浙江 溫州 325015）

Sirtuins（SIRT）家族（SIRT 1-7）是一類依賴于NAD+-的乙?；?、脫乙酰酶和ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶家族，它們在基因組穩(wěn)定性、能量代謝以及衰老等方面發(fā)揮著重要作用[1]。幾乎所有的SIRT家族成員都被認(rèn)為在腫瘤的發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用[2]。SIRT4位于線粒體是NAD+-依賴的ADP核糖轉(zhuǎn)移酶，它能抑制谷氨酰胺脫氫酶的活性[3]。研究表明，SIRT4可以通過抑制谷氨酰胺代謝從而具有抑癌基因的作用[4-5]。研究還發(fā)現(xiàn)SIRT4在結(jié)腸癌和食管癌中的表達(dá)降低與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)[6-8]。本課題組前期通過對胃癌組織芯片進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SIRT4的蛋白水平在胃癌組織中降低，并與更差的病理分級、T分期以及UICC分期相關(guān)[9]。然而，SIRT4對胃癌細(xì)胞的作用目前仍不清楚。本研究探討過表達(dá)SIRT4對胃癌細(xì)胞SGC-7901和MNK45的體外增殖及周期的影響，以進(jìn)一步明確SIRT4與胃癌的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 載體和病毒產(chǎn)生：SIRT4慢病毒載體購自上海漢恒生物公司。表達(dá)SIRT4的載體為pHBLVCMVIE-ZsGreen-T2A-Puro。過表達(dá)慢病毒和陰性對照病毒的最終病毒滴度為2×108PFU/mL。

1.1.2 細(xì)胞系：人胃癌細(xì)胞系SGC-7901和MNK45購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.1.3 主要試劑：胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素購自美國Gibco公司；PI/Nase購自美國BD公司；RIPA緩沖液等免疫印跡試劑購自上海碧云天公司?？贵w：兔抗人多克隆抗體（HPA029691，SIRT4）購自美國Sigma公司，兔抗人cyclin D蛋白單克隆抗體（60816-1-ig）購自武漢三鷹公司，兔抗人cyclin E單克隆抗體（ab33911）購自英國Abcam公司，兔抗人ERK多克隆抗體（9102）和兔抗人p-ERK多克隆抗體（4370）購自美國CST公司，羊抗兔抗體（ab97200）和兔抗人β-actin抗體（ab11971）購自英國Abcam公司，兔抗人GAPDH多克隆抗體（ab-p-r 001）購自深圳志賢生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組：細(xì)胞在DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中含有10%的胎牛血清以及青霉素和鏈霉素雙抗。培養(yǎng)箱條件：37 ℃，5% CO2。過表達(dá)SIRT4的細(xì)胞系經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后，在2 μg/mL的嘌呤霉素中篩選2周。將細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染過表達(dá)SIRT4慢病毒（SIRT4）組和轉(zhuǎn)染陰性對照病毒（Vector）組。

1.2.2 細(xì)胞增殖活力：以1 000細(xì)胞/孔接種于96孔板，每孔中加入10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，在450 nm波長處讀取吸光度值。

1.2.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)：將對數(shù)生長期細(xì)胞以100細(xì)胞/孔接種于6孔板，每2～3 d換液。培養(yǎng)2周后，將細(xì)胞用甲醇固定，再用姬姆薩染色后直接計(jì)數(shù)肉眼能觀察到的集落數(shù)。

1.2.4 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化和離心分離后，懸浮在含3%胎牛血清的磷酸鹽緩沖溶液中，用PI/Nase試劑盒進(jìn)行染色，在流式細(xì)胞儀C6上進(jìn)行檢測，結(jié)果用ModFit分析軟件（Verity Software House，TOPSHAM，ME，美國）分析。

1.2.5 Western blot實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞用RIPA緩沖液在冰水浴中裂解30 min，離心，收集上清液，用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。將等量的蛋白質(zhì)加樣到

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料用±s表示，2組間比較用t檢驗(yàn)，細(xì)胞周期分布用ModFit軟件進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)SIRT4對人胃癌細(xì)胞增殖的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)SIRT4后人胃癌細(xì)胞SGC-7901和MNK45的增殖活力顯著下降，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1B-C；SGC-7901和MNK45的克隆形成數(shù)目和大小在過表達(dá)SIRT4之后也明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1D。

2.2 過表達(dá)SIRT4對胃癌細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)碘化丙胺染色法結(jié)果表明，與Vector組比，SIRT4組的SGC-7901和MNK45 G0/G1期細(xì)胞的分布顯著增加，并且S期細(xì)胞的比例顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在SGC-7901細(xì)胞中，過表達(dá)SIRT4增加了細(xì)胞在G2期的分布，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3 過表達(dá)SIRT4對G1期相關(guān)蛋白的影響 Western blot檢測表明，SIRT4降低了SGC-7901和MNK45細(xì)胞G1周期調(diào)節(jié)蛋白cyclin D、cyclin E和p-ERK表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

3 討論

研究表明，多個(gè)SIRT家族成員在不同的腫瘤中扮演了不同的角色，這可能取決于特定的組織和腫瘤類型[10]。如SIRT1在胃癌[11]、結(jié)腸癌[12]、前列腺癌[13]及皮膚癌[14]中表達(dá)升高，但其在乳腺癌中的表達(dá)是降低的[15]，且在小鼠APC模型中過表達(dá)SIRT1可阻斷小鼠腸道腫瘤的形成[16]。目前關(guān)于SIRT4在腫瘤中功能的研究不多，但都認(rèn)為SIRT4具有抑癌基因的作用。JEONG等[4]發(fā)現(xiàn)SIRT4能通過抑制谷氨酰胺代謝來抑制腫瘤的形成；過表達(dá)SIRT4能抑制Hela細(xì)胞的增殖；敲除SIRT4的MEF細(xì)胞能在裸鼠中形成更大的腫瘤；敲除SIRT4基因的小鼠可自發(fā)形成肺癌、肝癌、乳腺癌和淋巴癌。CSIBI等[5]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SIRT4能抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株DLD-1和聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，通過電印跡法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將PVDF膜放置于10%脫脂乳蛋白中，在室溫下孵育1 h后與稀釋后的一抗在4O ℃條件下過夜。第2天用二抗室溫下孵育30 min后用HRP-ECL熒光法檢測目標(biāo)蛋白，用凝膠成像儀器拍攝圖像。人前列腺癌細(xì)胞株DU145的增殖。JEONG等[17]發(fā)現(xiàn)SIRT4對Myc誘導(dǎo)的B細(xì)胞淋巴瘤生長有抑制作用。

圖1 過表達(dá)SIRT4抑制胃癌細(xì)胞增殖

圖2 過表達(dá)SIRT4對胃癌細(xì)胞周期的影響

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SIRT4表達(dá)降低與結(jié)腸癌和食管癌患者更差的預(yù)后相關(guān)[6，8]，SIRT4在胃癌中的表達(dá)與胃癌患者的病理分期、T分期和UICC分期等病理學(xué)參數(shù)相關(guān)[9]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SIRT4在胃癌中起著抑癌基因的作用。

為了進(jìn)一步研究過表達(dá)SIRT4抑制胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)研究了過表達(dá)SIRT4之后胃癌細(xì)胞的周期分布。結(jié)果表明，過表達(dá)SIRT4導(dǎo)致了胃癌細(xì)胞SGC-7901和MNK45的G1期阻滯。此外，還觀察到過表達(dá)SIRT4顯著降低了胃癌細(xì)胞中cyclin D、cyclin E和p-ERK的表達(dá)。研究表明，細(xì)胞周期素D在癌細(xì)胞中的表達(dá)增加導(dǎo)致細(xì)胞生長失控[18]。ERK通過調(diào)節(jié)cyclin D[19]來控制G1期細(xì)胞周期。細(xì)胞周期素E在調(diào)節(jié)G1至S期轉(zhuǎn)變[20]中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。這些結(jié)果提示，SIRT4誘導(dǎo)的G1期阻滯與ERK、cyclin D和cyclin E的下調(diào)有關(guān)。

圖3 過表達(dá)SIRT4對G1細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響

本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SIRT4能抑制胃癌細(xì)胞的體外增殖，這可能是通過下調(diào)ERK、cyclin D和cyclin E的表達(dá)導(dǎo)致胃癌細(xì)胞的G1期阻滯實(shí)現(xiàn)的。結(jié)果提示SIRT4在胃癌中扮演了抑癌基因的作用，SIRT4可能是一個(gè)很有前途的胃癌治療靶點(diǎn)。