謝旦立，鄭蒙蒙，鄭斌嬌，樓永良

（溫州醫(yī)科大學(xué)，溫州 325035，1.檢驗醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院；2.檢驗醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室）

流式細胞儀是一種多參數(shù)條件下快速分析和精確分選細胞的現(xiàn)代化實驗教學(xué)和科研儀器。隨著流式細胞儀、熒光探針種類和熒光探針標記技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，流式細胞儀的應(yīng)用領(lǐng)域和范圍不斷被拓展，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床檢驗、生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)和材料學(xué)等不同學(xué)科和技術(shù)領(lǐng)域[1-8]。因此，流式細胞技術(shù)平臺已成為各大院校、高水平醫(yī)院和科研院所科研技術(shù)平臺的重要組成[9]。

目前，全球商業(yè)化的流式細胞儀主要分兩類：一類以分析功能為主，應(yīng)用于臨床檢測及常規(guī)科研，一般具有操作相對簡單，易掌握的優(yōu)點；另一類是具有高速分選功能的高端科研型，研發(fā)趨勢是越來越多的熒光檢測參數(shù)和越來越快的分選速度。相比分析型流式，這類產(chǎn)品一般來說操作較復(fù)雜，難掌握。作為醫(yī)學(xué)院校，溫州醫(yī)科大學(xué)（以下簡稱我校）目前也已裝備多臺流式細胞儀，包括BD FACS AriaII（分析/分選型）、BECKMAN COULTER Moflo XDP（分析/分選型）、BECKMAN COULTER CytoFLEX（分析型）和BD Accuri C6（分析型）等，并在醫(yī)學(xué)免疫學(xué)和臨床免疫學(xué)檢驗等本科生課程、細胞生物學(xué)技術(shù)等碩士研究生課程中開設(shè)了流式細胞術(shù)的實驗和理論課，旨在培養(yǎng)學(xué)生對流式細胞術(shù)理論、操作和應(yīng)用能力的有效結(jié)合。流式細胞術(shù)是目前生物醫(yī)學(xué)科研平臺必不可缺的技術(shù)，開設(shè)研究生流式細胞課程和技術(shù)培訓(xùn)，將為研究生今后從事相關(guān)科研工作提供技術(shù)保障。因此，隨著流式細胞技術(shù)的不斷發(fā)展，如何建設(shè)好流式細胞技術(shù)服務(wù)平臺，如何提供多樣化和高水平的流式細胞應(yīng)用及深度開發(fā)現(xiàn)有平臺的技術(shù)服務(wù)項目等一系列問題，越來越受到高校和各類科研院所的關(guān)注。筆者結(jié)合流式細胞儀使用的心得，探討流式細胞儀在實驗教學(xué)和技術(shù)平臺建設(shè)等方面的應(yīng)用。

1 積極引入前沿流式細胞實驗技術(shù)和解決方案

目前，國內(nèi)多數(shù)醫(yī)學(xué)院校流式本科實驗教學(xué)主要在免疫學(xué)及其相關(guān)的實驗課等課程中涉及，內(nèi)容包括講解流式細胞儀的原理、方法、步驟和應(yīng)用等[10-13]。從1980年北京師范大學(xué)生物系引進國內(nèi)第一臺流式細胞儀（BD FACSIII）以來，國內(nèi)的流式細胞儀裝機總量和應(yīng)用水平已經(jīng)有長足的發(fā)展與進步，其中大部分裝機的流式細胞儀以分析型為主。隨著我們國家對基礎(chǔ)科研的不斷重視及高水平研究成果的不斷涌現(xiàn)，流式細胞儀的綜合應(yīng)用已不局限于細胞周期和細胞凋亡或兩色、三色和四色等。而流式細胞儀在這30年里也快速發(fā)展，包括激光器種類和數(shù)量、可檢測的熒光類型和數(shù)量、品牌種類、各種專利技術(shù)等方面的不斷進步。因此，為適應(yīng)流式細胞技術(shù)日新月異的發(fā)展，幫助學(xué)生拓展科研思路，亟需在醫(yī)學(xué)院校研究生培養(yǎng)中引入前沿的流式細胞實驗技術(shù)，開發(fā)在新時期下與時俱進的流式細胞技術(shù)平臺。

根據(jù)我校目前的科研需要，我們以科研平臺BD FACS AriaII流式細胞儀為例，主要列舉：①基于多色分析的Carboxyfluorescein succinimidyl ester（CFSE）標記法和Bromodeoxyuridine（BrdU）摻入法的細胞增殖功能檢測；②基于多色分析的體內(nèi)細胞蛋白質(zhì)磷酸化水平檢測；③基于多色分析的細胞因子多因子檢測；④基于BD Index分選功能的快速細胞單克隆化及在研究生培養(yǎng)中的應(yīng)用。

1.1 基于多色分析的CFSE標記法和BrdU摻入法的細胞增殖功能檢測 細胞增殖功能檢測是目前細胞生物學(xué)和免疫學(xué)實驗研究中的常見技術(shù)和實驗方法。常規(guī)的方法包括MTT法、CCK-8法和細胞周期法等，但存在靈敏度較低、操作復(fù)雜、實驗結(jié)果不夠直觀和教學(xué)效果較差等問題。在科研工作中，我們采用CFSE標記法來跟蹤被標記體外培養(yǎng)細胞的分裂增殖情況，并在臨床檢驗診斷學(xué)、生物學(xué)和免疫學(xué)專業(yè)碩士研究生的流式細胞技術(shù)理論或?qū)嵺`中進行推廣應(yīng)用，以替換上述傳統(tǒng)實驗方法，拓寬相關(guān)專業(yè)研究生對體外檢測細胞增殖功能技術(shù)的認識面。多參數(shù)分析條件下的CFSE標記法相比傳統(tǒng)MTT等方法在檢測體外培養(yǎng)細胞的分裂增殖功能中具有結(jié)果更直觀、更全面的優(yōu)點，如可同時檢測混合培養(yǎng)細胞中特定細胞亞群雙參數(shù)（細胞因子表達 vs.分裂增殖、細胞存活率 vs. 分裂增殖）下細胞增殖與其他細胞功能事件關(guān)系等（見圖1-2）。此外，由于MTT和CCK-8法無法直接檢測體內(nèi)細胞的分裂增殖能力，我們將BrdU腹腔注射實驗小鼠，利用BrdU摻入法追蹤小鼠體內(nèi)特定類型細胞的分裂增殖功能情況（見圖3）。通過將CFSE標記和BrdU摻入法引入相關(guān)專業(yè)研究生的流式細胞技術(shù)理論和科研實驗技能培訓(xùn)中，使流式細胞技術(shù)的實驗課內(nèi)容更貼近于科研，拓寬流式細胞技術(shù)服務(wù)的應(yīng)用領(lǐng)域。

圖1 流式細胞術(shù)檢測活化后小鼠脾臟CD4+T細胞CFSE/IL-2雙參數(shù)分析細胞增殖與IL-2表達

圖2 流式細胞術(shù)檢測活化后小鼠脾臟CD4+T細胞CFSE/細胞死活染料雙參數(shù)分析細胞增殖與細胞存活率關(guān)系的示意圖

圖3 流式細胞術(shù)檢測細菌感染小鼠對肝巨噬細胞分裂增殖能力影響

1.2 基于多色分析的體內(nèi)細胞蛋白質(zhì)磷酸化水平檢測 傳統(tǒng)的檢測細胞蛋白質(zhì)磷酸化水平的實驗方法主要通過Western blot，耗時較長，過程復(fù)雜，需采用內(nèi)參蛋白進行定量分析，且無法分析混合細胞樣品中某一群細胞蛋白質(zhì)的磷酸化水平。通過熒光標記的流式細胞磷酸化抗體，并采用胞內(nèi)染色的方法，流式細胞技術(shù)可檢測大多數(shù)胞內(nèi)蛋白磷酸化水平，且染色過程通?？梢栽? d內(nèi)完成，且無需內(nèi)參即可比較不同樣本或同一混合細胞樣本中不同群細胞某一蛋白磷酸化水平的差異，大幅縮短實驗時間（見圖4）。因此，開展該技術(shù)的教學(xué)，可提高相關(guān)專業(yè)研究生對蛋白質(zhì)磷酸化檢測的認識，使其在科研工作中能有的放矢地選擇最優(yōu)的方法來進行蛋白質(zhì)磷酸化的檢測，充分調(diào)動科研的主觀能動性，培養(yǎng)創(chuàng)新意識和創(chuàng)新能力，提高科研實踐能力。

圖4 流式細胞術(shù)檢測細菌感染小鼠對肝中性粒細胞AKT磷酸化的影響

1.3 基于多色分析的細胞因子多因子檢測的應(yīng)用細胞因子主要具有免疫調(diào)節(jié)等作用，與許多疾病的發(fā)生密切有關(guān)。細胞因子種類繁多，對于某一種細胞因子表達的檢測，以往的方法主要通過ELISA法進行定量測定，耗時長，通量小，一次僅能檢測一種細胞因子。隨著BD公司和BioLegend公司等相繼推出細胞因子多因子檢測試劑盒后，一般可同時檢測10種以上細胞因子的表達量，該法結(jié)合ELISA和流式細胞術(shù)的優(yōu)點，待測因子選擇靈活，研究人員可根據(jù)研究需要自由組合和定制檢測指標，檢測范圍寬，靈敏度高，樣品用量少，一般僅需25 μL以下，且可根據(jù)標準品制作標準曲線對樣品進行定量分析。我們采用了BioLegend公司的LEGENDplex細胞炎癥因子檢測（13因子）試劑盒，其能通過制備標準曲線，同時定量分析TNF-α、IFN-γ和IL-1β等13種細胞因子的表達（見圖5）。該試劑盒主要通過熒光微球技術(shù)的免疫“雙夾心”液相檢測方法，其中13種微球偶聯(lián)有對應(yīng)的13種細胞因子的生物素化的捕獲抗體，同時帶有不同強度APC熒光，并根據(jù)其大小分為A、B兩群，通過捕獲樣品中相對應(yīng)的細胞因子，再通過鏈親和素-PE反應(yīng)，檢測APC和PE雙信號來讀取13種細胞因子的表達情況。該法的理論和實踐教學(xué)可使研究生，尤其是科研課題涉及免疫相關(guān)技術(shù)的研究生在了解常規(guī)ELISA和流式細胞術(shù)檢測基本原理的基礎(chǔ)上，將兩者知識點有機連貫起來，并靈活結(jié)合到具體的科研實驗中，實現(xiàn)人員培訓(xùn)與前沿應(yīng)用之間的有效融合。

圖5 BioLegend多因子流式細胞術(shù)檢測試劑盒（13因子）細胞因子標準品檢測示意圖

1.4 基于BD克隆分選功能的快速細胞克隆化 細胞的克隆化是目前許多生物醫(yī)學(xué)課題中構(gòu)建各類基因工程改造細胞株所必需的過程。傳統(tǒng)的方法采用有限稀釋法同時結(jié)合抗生素篩選，該法耗時長。我們采用BD FACS AriaII分選模塊的克隆分選功能（也稱索引分選），將轉(zhuǎn)染后的單細胞分選至96孔細胞培養(yǎng)板中，經(jīng)培養(yǎng)后可快速獲得多個穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞克隆，大大縮短篩選時間（見圖6）。

圖6 BD FACS AriaII Index sorting模式示意圖

因此，我們通過利用CRISPR-Cas9技術(shù)細胞基因敲除實驗，對相關(guān)專業(yè)的研究生進行從質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)染、細胞培養(yǎng)和細胞克隆分選整個過程（見圖7）的理論、實驗技術(shù)培訓(xùn)。該實驗內(nèi)容設(shè)計，在體系上適合研究生較全面地理解和掌握細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)基本技術(shù)的同時，將流式細胞術(shù)真正融入到具體的案例中，發(fā)揮該技術(shù)的優(yōu)勢，不僅能夠更好地幫助研究生理解流式細胞克隆分選技術(shù)的重要性，更是培養(yǎng)和鍛煉他們科學(xué)思考能力，學(xué)會如何科學(xué)有效地選用合適高效的方法設(shè)計完成科研課題。此外，對于儀器應(yīng)用而言，此類涉及較多知識點的大型實驗，實驗中技術(shù)和知識覆蓋面廣，涵蓋了從分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)和免疫學(xué)等方法，并包括有細胞培養(yǎng)、分子克隆和轉(zhuǎn)染、流式細胞無菌樣本制備等步驟和技能。此類實驗?zāi)苠憻捬芯可鷮昧魇郊毎夹g(shù)全程綜合設(shè)計科研方案能力，培養(yǎng)研究生的科研創(chuàng)新意識和探索科研的興趣。

2 流式細胞技術(shù)平臺建設(shè)與研究生實踐教學(xué)的思考

圖7 利用BD FACS AriaII Index sorting功能和CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)快速獲得突變細胞株克隆的示意圖

流式細胞術(shù)已進入科研和臨床工作的各個方面，醫(yī)學(xué)院校研究生對流式細胞技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用了解較少，限制了流式細胞技術(shù)在研究生科研和臨床工作中的應(yīng)用。因此，醫(yī)學(xué)院校研究生中系統(tǒng)開展流式細胞技術(shù)理論和實踐訓(xùn)練刻不容緩：一方面，作為平臺建設(shè)而言，流式細胞技術(shù)平臺服務(wù)的對象主要是科研人員，以科研需求推動流式細胞技術(shù)平臺建設(shè)及人員培訓(xùn)，可較大程度搭建適合本單位的流式細胞技術(shù)平臺；另一方面，包含流式細胞多色分析和高端分選兩塊內(nèi)容的綜合性實驗教學(xué)項目，是提供高水平生物醫(yī)學(xué)研究服務(wù)的重要手段。以高水平技術(shù)建設(shè)高質(zhì)量平臺，以高質(zhì)量教學(xué)和科研技術(shù)平臺促進研究生教學(xué)質(zhì)量不斷提高等一系列形式，提高流式細胞技術(shù)平臺的水平、培養(yǎng)研究生對流式細胞技術(shù)的動手操作能力，為流式細胞技術(shù)平臺建設(shè)和研究生職業(yè)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

此外，考慮到目前流式細胞儀型號和品牌較多，高端機型為各廠家重點推薦的儀器。不論高端還是低端型號，機器不會思考問題，最為重要的還是操作人員。在選擇合適流式細胞儀時需充分調(diào)研，綜合各型號的突出優(yōu)點和不足之處，尤其是是否能緊密圍繞本單位科研工作需求，是否能對本單位現(xiàn)有技術(shù)平臺起重要提升作用為主要考量標準之一。緊密跟蹤和開展流式細胞技術(shù)的前沿應(yīng)用，尤其是對已有儀器功能和應(yīng)用的不斷開發(fā)，才能提升平臺技術(shù)人員對現(xiàn)有儀器性能的熟悉和了解，并可大幅度提高大型儀器利用率，最大程度發(fā)揮現(xiàn)有儀器的資源優(yōu)勢、技術(shù)應(yīng)用范圍和師資特長，還可提高研究生的科研專業(yè)訓(xùn)練水平，有助于其今后真正將流式細胞技術(shù)運用于自己的科研和臨床工作中。