蘇 喬，李武國，李雯雯，趙廣銀，周永標(biāo)，李潤光，潘衛(wèi)松

（1.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，廣東廣州510080； 2.廣州市藥品檢驗(yàn)所，廣東廣州510610；3.廣東省鶴山市昆侖養(yǎng)生美容酒廠有限公司，廣東江門529700）

潤光養(yǎng)生美容酒是中醫(yī)養(yǎng)生美容專家李潤光教授在祖?zhèn)黟B(yǎng)生美容寶典《回春部》的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代中醫(yī)養(yǎng)生美容理論研制出來的一種可供內(nèi)服、外用的酒劑。它主要由烏梅、桂圓肉、枸杞、陳皮、黑棗、茯苓、佛手、羅漢果、山楂、花椒等中藥經(jīng)露酒浸泡制得。該酒在臨床上被用于外敷，灌注直腸、陰道等。本研究對其皮膚急性毒性、皮膚刺激性以及黏膜刺激性進(jìn)行研究，為其在臨床上的安全應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

普通級新西蘭兔88只，雌雄兼有，體重1.8～3.3 kg，廣州市花都區(qū)花東信華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號為SCXK（粵）2014—0023）；SPF級雌性SD大鼠30只，180～200 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號為SCXK（湘）2011—0003）；潤光養(yǎng)生美容酒（酒精度為45%vol）、潤光養(yǎng)生美容酒酒基（酒精度為60%vol）（以下簡稱酒基），廣東省鶴山市昆侖美容酒廠有限公司；注射用水（批號：1501033205）石家莊四藥有限公司；0.9%氯化鈉注射液（批號：N15040203-1），四川科倫藥業(yè)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 完整皮膚急性毒性試驗(yàn)[1]

普通級新西蘭兔12只，雌雄兼有，體重2.7～3.3 kg。于給藥前24 h，電動(dòng)剃毛刀將背部脊柱兩側(cè)去毛，去毛面積約為體表面積的10%。去毛后24 h檢查去毛皮膚是否因去毛而受傷，受傷的皮膚不宜作完好皮膚的毒性試驗(yàn)。按體重分籠，隨機(jī)分為3組，每組4只，雌雄兼有，以受試物4 mL/只的劑量作為高劑量組，以受試物1 mL/只的劑量作為低劑量組，溶劑對照組給予酒基應(yīng)用液（酒精度為45%vol），每只兔涂抹1 mL。受試物均勻涂于脫毛區(qū)，并用無刺激性紗布膠布加以固定。每只動(dòng)物分籠飼養(yǎng)。給受試物24 h后，以溫水除去殘留的受試物，去除受試物后1 h、24 h、48 h、72 h至第7天，每日觀察并記錄動(dòng)物的體重、皮膚毛發(fā)、眼和黏膜的變化、呼吸、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、四肢活動(dòng)等及其他中毒表現(xiàn)，若遇有死亡動(dòng)物，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行尸檢和肉眼觀察，當(dāng)肉眼可見病變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

1.2.2 破損皮膚急性毒性試驗(yàn)[1]

普通級新西蘭兔12只，雌雄兼有，體重2.7～3.3 kg。于給藥前24 h，電動(dòng)剃毛刀將背部脊柱兩側(cè)去毛，去毛面積約為體表面積的10%。用8號針頭劃破皮膚至微微滲血。按體重分籠，隨機(jī)分為3組，每組4只，雌雄兼有，以受試物4 mL/只的劑量作為高劑量組，以受試物1 mL/只的劑量作為低劑量組，溶劑對照組給予酒基應(yīng)用液（酒精度45%vol），每只兔涂抹1 mL。受試物均勻涂于脫毛區(qū)，并用無刺激性紗布膠布加以固定。每只動(dòng)物分籠飼養(yǎng)。給受試物24 h后，以溫水除去殘留的受試物，去除受試物后1 h、24 h、48 h、72 h至第7天，每日觀察并記錄動(dòng)物的體重、皮膚毛發(fā)、眼和黏膜的變化、呼吸、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、四肢活動(dòng)等及其他中毒表現(xiàn)，若遇有死亡動(dòng)物，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行尸檢和肉眼觀察，當(dāng)有肉眼可見病變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

1.2.3 完整皮膚刺激性試驗(yàn)[2]

普通級新西蘭兔4只，雌雄兼有，體重2.7～3.1 kg。于給藥前24 h，電動(dòng)剃毛刀將背部脊柱兩側(cè)去毛，去毛面積約為體表面積的10%。去毛后24 h檢查去毛皮膚是否因去毛而受傷，受傷的皮膚不宜作完好皮膚的刺激性試驗(yàn)。試驗(yàn)采用同體左右側(cè)自身對比，左側(cè)去毛區(qū)涂受試物1 mL，右側(cè)涂1 mL酒基應(yīng)用液（酒精度為45%vol）作為對照，用無刺激性紗布、膠布加以固定。每只動(dòng)物分籠飼養(yǎng)。給受試物24 h后，以溫水除去殘留的受試物，去除受試物后1 h、24 h、48 h、72 h肉眼觀察和病理組織學(xué)檢查并記錄涂抹部位有無紅斑和水腫等情況，按《中藥新藥研究指南》皮膚刺激性反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，記錄各時(shí)日的評分值及恢復(fù)情況和時(shí)間。

1.2.4 破損皮膚刺激性試驗(yàn)[2]

普通級新西蘭兔4只，雌性雄性兼有，體重2.7～3.1 kg。于給藥前24 h，電動(dòng)剃毛刀將背部脊柱兩側(cè)去毛，去毛面積約為體表面積的10%。用8號針頭劃破皮膚至微微滲血。試驗(yàn)采用同體左右側(cè)自身對比，左側(cè)去毛區(qū)涂受試物1 mL，右側(cè)涂1 mL酒基應(yīng)用液（酒精度為45%vol）作為對照，用無刺激性紗布、膠布加以固定。每只動(dòng)物分籠飼養(yǎng)。給受試物24 h后，以溫水除去殘留的受試物，去除受試物后1 h、24 h、48 h、72 h肉眼觀察和病理組織學(xué)檢查并記錄涂抹部位有無紅斑和水腫等情況，按《中藥新藥研究指南》皮膚刺激性反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，記錄各時(shí)日的評分值及恢復(fù)情況和時(shí)間。

1.2.5 兔直腸刺激性試驗(yàn)[3]

預(yù)試驗(yàn)：普通級雌性新西蘭兔10只，體重1.8～2.2 kg。經(jīng)由直腸用F10導(dǎo)尿管插入深度為8 cm，灌注給入潤光養(yǎng)生美容酒原液（酒精度45%vol），灌注劑量為10 mL/kg·BW，共灌注3次，每次間隔10 min，灌注前禁食16 h，不禁水，灌注后30 min內(nèi)全部死亡。

正式試驗(yàn)：普通級雌性新西蘭兔46只，體重1.8～2.8 kg。按體重分籠，隨機(jī)分為6組，潤光養(yǎng)生美容酒高劑量（酒精度為3.6%vol）組、低劑量（酒精度為1.8%vol）組，每組10只；酒基（酒精度為3.6%vol）組，9只；生理鹽水組，8只；器械對照組，6只；正常對照組，3只。取潤光養(yǎng)生美容酒原液（酒精度為45%vol），經(jīng)注射用水稀釋配制成酒精度為3.6%vol和1.8%vol的受試液，另外酒基同法配制成酒精度為3.6%vol的受試液。動(dòng)物用F10導(dǎo)尿管插入直腸深度為8 cm，灌注給入上述濃度的溶液，每次灌注劑量為10 mL/kg·BW（灌注前禁食16 h，不禁水），共灌注3次。每次間隔10 min，受試液自然流出。正常對照組不作任何處理，常規(guī)飼養(yǎng)。器械對照組按上述流程進(jìn)行，但不灌注任何溶液。觀察給受試液后24 h、48 h時(shí)，受試物全身及局部刺激反應(yīng)情況。24 h、48 h后處死部分動(dòng)物，取直腸，觀察腸黏膜有無充血、水腫等變化，并作病理組織學(xué)檢查，與對照組比較。部分留存動(dòng)物逐日觀察并記錄其體重、呼吸、循環(huán)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及四肢活動(dòng)等變化情況。第7天處死動(dòng)物檢查直腸黏膜組織的變化。

1.2.6 大鼠陰道刺激性試驗(yàn)[3]

SPF級雌性SD大鼠30只，體重為180～200 g，按體重分籠，隨機(jī)分為3組，潤光養(yǎng)生美容酒（酒精度為45%vol）組、酒基（酒精度為45%vol）組和生理鹽水組，每組10只。各組采用F8導(dǎo)尿管陰道灌注給予相應(yīng)受試物，導(dǎo)尿管插入深度為2 cm，灌注后用火棉膠封住陰道口4 h。觀測給受試物后24 h時(shí)全身情況及局部刺激反應(yīng)。24 h后處死部分動(dòng)物，取陰道，觀察黏膜有無充血、水腫等變化，并作病理組織學(xué)檢查，與對照組比較。部分留存動(dòng)物逐日觀察并記錄其全身狀況。體重、呼吸、循環(huán)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及四肢活動(dòng)等變化。第7天處死動(dòng)物檢查陰道的變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 完整皮膚急性毒性試驗(yàn)

在完整皮膚急性毒性試驗(yàn)中，試驗(yàn)動(dòng)物完整皮膚1 d內(nèi)分別涂抹潤光養(yǎng)生美容酒原液（酒精度為45%vol）1 mL和4 mL，動(dòng)物進(jìn)食、活動(dòng)正常，體重增加，未見經(jīng)皮膚吸收引起的毒性反應(yīng)。

2.2 破損皮膚急性毒性試驗(yàn)

在破損皮膚急性毒性試驗(yàn)中，試驗(yàn)動(dòng)物破損皮膚1 d內(nèi)分別涂抹潤光養(yǎng)生美容酒原液（酒精度為45%vol）1 mL和4 mL，動(dòng)物進(jìn)食、活動(dòng)正常，體重增加，未見經(jīng)皮膚吸收引起的毒性反應(yīng)。

2.3 完整皮膚刺激性試驗(yàn)

在完整皮膚刺激性試驗(yàn)中，試驗(yàn)動(dòng)物完整皮膚涂抹潤光養(yǎng)生美容酒原液（酒精度為45%vol）1 mL，未見經(jīng)接觸皮膚后產(chǎn)生的刺激性反應(yīng)。

2.4 破損皮膚刺激性試驗(yàn)

在破損皮膚刺激性試驗(yàn)中，試驗(yàn)動(dòng)物破損皮膚涂抹潤光養(yǎng)生美容酒原液（酒精度為45%vol）1 mL，未見經(jīng)接觸皮膚后產(chǎn)生的刺激性反應(yīng)。

2.5 兔直腸刺激性試驗(yàn)

2.5.1 預(yù)試驗(yàn)

在兔直腸刺激性試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)中，潤光養(yǎng)生美容酒原液（酒精度為45%vol）灌注劑量為10 mL/kg·BW（共灌注3次，每次間隔10 min），經(jīng)兔直腸黏膜給入可引起動(dòng)物死亡，產(chǎn)生急性毒性反應(yīng)。

2.5.2 正式試驗(yàn)

圖1 潤光養(yǎng)生美容酒對兔直腸黏膜的刺激性試驗(yàn)病理學(xué)檢測結(jié)果（HE，×100）

各組動(dòng)物經(jīng)解剖肉眼檢查直腸黏膜組織外觀、色澤、大小正常。顯微鏡下黏膜表層完整，黏膜面未見異常滲出、出血、糜爛等；腺體未見萎縮或增生等；黏膜下層未見水腫（見圖1）。與正常對照組比較，生理鹽水組、器械對照組在灌注后24 h、7 d均沒有顯著的變化。與生理鹽水組比較，潤光養(yǎng)生美容酒酒精度為3.6%vol組在灌注后24 h并沒有顯著的變化，48 h后出現(xiàn)了嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，7 d后炎癥反應(yīng)恢復(fù)到了生理鹽水組的水平；酒精度為1.8%vol組在灌注后24 h、48 h與7 d均出現(xiàn)了比生理鹽水組稍嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)；而酒基（酒精度為45%vol）組在灌注后24 h、48 h出現(xiàn)了嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，7 d后炎癥反應(yīng)減輕，但并未能恢復(fù)到生理鹽水組的水平。結(jié)果顯示，潤光養(yǎng)生美容酒原液（酒精度為45%vol），經(jīng)稀釋后酒精度為3.6%vol和1.8%vol的稀釋液以及3.6%vol的酒基稀釋液均能對兔直腸黏膜產(chǎn)生刺激性作用。

圖2 潤光養(yǎng)生美容酒對大鼠陰道黏膜刺激性試驗(yàn)病理學(xué)檢測結(jié)果（HE，×400）

2.6 大鼠陰道刺激性試驗(yàn)

在大鼠陰道灌注劑量為10 mL/kg·BW的刺激性試驗(yàn)中，生理鹽水組、酒基（酒精度為45%vol）組和潤光養(yǎng)生美容酒原液（酒精度為45%vol）組經(jīng)肉眼檢查大鼠陰道組織外觀、色澤、大小正常。顯微鏡下檢查陰道組織內(nèi)膜呈相應(yīng)生理周期正常改變；未見腺體異常增生或萎縮（見圖2）。樣品原液與生理鹽水組比較對大鼠陰道刺激性無顯著性差異。

3 結(jié)論

潤光養(yǎng)生美容酒原液未見經(jīng)皮膚吸收引起的急性毒性反應(yīng)和經(jīng)接觸皮膚后產(chǎn)生的刺激性反應(yīng)。潤光養(yǎng)生美容酒原液以及經(jīng)稀釋至酒精度為3.6%vol、酒精度為1.8%vol的稀釋液均能對兔直腸產(chǎn)生刺激性作用。潤光養(yǎng)生美容酒原液對大鼠陰道未見刺激性作用。