陳 剛，殷鐘意，鄭旭煦

(重慶市天然藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶工商大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，重慶 400067)

隨著人們生活水平的提高和飲食習(xí)慣的改變，近幾十年來(lái)痛風(fēng)的發(fā)病率逐年升高[1]。痛風(fēng)是因?yàn)檠蛩釢舛冗^(guò)高，導(dǎo)致尿酸鹽(monosodium urate，MSU)晶體沉積在關(guān)節(jié)及其周?chē)M織中，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生的無(wú)菌性炎癥反應(yīng)。越來(lái)越多的資料提示，MSU誘導(dǎo)的核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)活化和炎性介質(zhì)大量產(chǎn)生在痛風(fēng)炎癥發(fā)生、發(fā)展中起了重要作用[2]。在非活化狀態(tài)下，NF-κB p65蛋白與NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)α結(jié)合而存在于細(xì)胞質(zhì)中。MSU可與關(guān)節(jié)局部細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維樣滑膜細(xì)胞表面的Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)-2和TLR-4結(jié)合，通過(guò)磷脂酶C和D、Src酪氨酸激酶、G蛋白或者絲裂原激活的蛋白激酶等信號(hào)通路，促使IκBα泛素化降解，導(dǎo)致p65蛋白核轉(zhuǎn)移，促進(jìn)多種炎性介質(zhì)基因如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-6大量轉(zhuǎn)錄，最終促進(jìn)痛風(fēng)炎癥的發(fā)生與發(fā)展[3]。

在中醫(yī)藥臨床實(shí)踐中，牡丹皮是用于痛風(fēng)治療的常用中藥之一。丹皮酚是牡丹皮中主要的藥理成分，已被證實(shí)具有抗炎、鎮(zhèn)痛、降血糖、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗心律失常、抗菌、抗腫瘤等藥理作用[4]。丹皮酚抗炎藥理作用已經(jīng)在多種動(dòng)物炎性模型上得到證實(shí)[5]，但是丹皮酚對(duì)MSU誘導(dǎo)的痛風(fēng)炎癥發(fā)生、發(fā)展影響如何，至今未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬采用MSU誘導(dǎo)的大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(MSU-induced gouty arthritis，MGA)模型，觀察丹皮酚對(duì)關(guān)節(jié)腫脹、關(guān)節(jié)功能、關(guān)節(jié)病理?yè)p傷、炎性介質(zhì)表達(dá)和NF-κB活化的影響，以明確丹皮酚是否有抗痛風(fēng)的藥理作用及其潛在的藥理機(jī)制，為利用丹皮酚研發(fā)新的抗痛風(fēng)藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1試劑丹皮酚、尿酸、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)試劑盒，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；秋水仙堿(colchicine)片購(gòu)自云南植物藥業(yè)有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字H5302016，批號(hào)20160802)；TNF-α抗體、IL-1β抗體、IL-6抗體、免疫組織化學(xué)染色試劑盒(二步法)，均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；IκBα抗體、p65抗體、β-actin抗體，均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；PVDF膜和ECL試劑購(gòu)自美國(guó)Milipore公司；RIPA裂解液和BCA蛋白測(cè)定試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器RC24型高速冷凍離心機(jī)(Thermo Scientific Sorvall公司)；PBC7140足體積檢測(cè)儀(Ugo Basile公司)；Infinite M200型全標(biāo)儀(BioTek公司)；ChemiDoc XRS型成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；80i型正置熒光顯微鏡(Nikon公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，♂，體質(zhì)量(200～240) g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(渝)2016-0012。所有動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1MSU晶體的制備[6]4 g尿酸溶解于預(yù)熱至60℃的800 mL蒸餾水中，用0.5 mol·L-1氫氧化鈉調(diào)整pH至8.9后，4℃靜置過(guò)夜。溶液經(jīng)4 000 r·min-1離心10 min，取沉淀為MSU晶體，純乙醇洗3次，干燥后高壓滅菌。

2.2模型制備與分組給藥SD大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，具體如下：對(duì)照組(Control)、模型組(MGA)、陽(yáng)性對(duì)照組(0.3 mg·kg-1秋水仙堿)、丹皮酚組(50、100、200 mg·kg-1)。丹皮酚、秋水仙堿組連續(xù)灌胃給藥7 d，每天1次，對(duì)照組與模型組給予同體積生理鹽水。d 5給藥后1 h 給予大鼠右后足踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.1 mL MSU溶液[7](MSU混懸于生理鹽水，終濃度為20 g·L-1)，對(duì)照組大鼠右踝關(guān)節(jié)腔注射0.1 mL生理鹽水。繼續(xù)給藥2 d，于造模后48 h麻醉處死動(dòng)物，取材進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

2.3關(guān)節(jié)體積檢測(cè)分別于造模前(0 h)，造模后2、6、12、24、48 h檢測(cè)右踝關(guān)節(jié)體積。

2.4步態(tài)評(píng)分檢測(cè)造模后24 h檢測(cè)大鼠步態(tài)評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下[7]，0分：雙足正常行走；1分：輕度跛行，左后足可著地；2分：中度跛行，左后足可著地但馬上收回；3分：重度跛行，左后足不能著地，只能3足著地行走。

2.5組織學(xué)評(píng)分檢測(cè)取大鼠右后足踝關(guān)節(jié)，于4%多聚甲醛緩沖液中固定24 h，10% EDTA溶液脫鈣28 d，常規(guī)脫水，透明，包埋，切片，蘇木精伊紅染色，然后進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分[8]。評(píng)分參數(shù)包括組織腫脹、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜組織增生和組織壞死。計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)如下，0分：正常；1分：輕度病變；2分：中度病變；3分：重度病變。關(guān)節(jié)體積、步態(tài)分析及組織學(xué)評(píng)分檢測(cè)均由不知道本研究方案的實(shí)驗(yàn)員完成。

2.6TRAP染色檢測(cè)取上述實(shí)驗(yàn)所制備的切片，按照TRAP染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，100倍鏡下計(jì)數(shù)TRAP陽(yáng)性(酒紅色)染色細(xì)胞數(shù)作為破骨細(xì)胞數(shù)量。

2.7免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)取上述實(shí)驗(yàn)制備的切片，按照“二步法”免疫組織化學(xué)染色試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。所用抗體分別為抗TNF-α、抗IL-1β、抗IL-6抗體。DAB顯色，中性樹(shù)膠封片。200倍鏡下分析陽(yáng)性染色的光密度值，隨機(jī)取同組10張切片的平均光密度值代表該細(xì)胞因子的表達(dá)值。

2.8Westernblot檢測(cè)取大鼠左后足踝關(guān)節(jié)滑膜組織，加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑反復(fù)勻漿，4℃下12 000 r·min-1離心15 min后取上清。取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，4℃下與IκBα抗體、p65抗體或者β-actin抗體共同孵育過(guò)夜，再與相應(yīng)的二抗室溫共同孵育1 h，加入ECL發(fā)光試劑后，成像系統(tǒng)檢測(cè)分析信號(hào)。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的光密度比值代表該目的蛋白的表達(dá)值。

3 結(jié)果

3.1丹皮酚對(duì)MGA大鼠足腫脹和步態(tài)評(píng)分的影響如Tab 1所示，與對(duì)照組相比，踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MSU 6 h后大鼠即出現(xiàn)明顯的足腫脹(P<0.01)，12 h后足腫脹達(dá)到最高值(P<0.01)，并持續(xù)至注射MSU后48 h(P<0.01)，而對(duì)照組大鼠足體積則無(wú)明顯變化。與MGA組相比，給予0.3 mg·kg-1秋水仙堿、丹皮酚(100、200 mg·kg-1)治療后，均使得MSU致炎48 h后的大鼠足腫脹明顯減輕(P<0.05或P<0.01)；但給予50 mg·kg-1丹皮酚治療對(duì)MSU致炎48 h后的大鼠足腫脹無(wú)明顯影響。與此同時(shí)，如Tab 2所示，踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MSU 24 h導(dǎo)致大鼠步態(tài)評(píng)分?jǐn)?shù)值明顯增高。與MGA組相比，給予0.3 mg·kg-1秋水仙堿、丹皮酚(100、200 mg·kg-1)治療后，均使MGA大鼠步態(tài)評(píng)分明顯降低(P<0.05或P<0.01)，但給予50 mg·kg-1丹皮酚治療對(duì)MGA大鼠步態(tài)評(píng)分無(wú)明顯影響。

3.2丹皮酚對(duì)MGA大鼠組織學(xué)評(píng)分和破骨細(xì)胞活化的影響如Tab 2、Fig 1所示，與對(duì)照組比較，注射MSU 48 h后，大鼠踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯的滑膜增生、腫脹，嚴(yán)重者出現(xiàn)壞死，同時(shí)伴隨有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，因此模型組組織學(xué)評(píng)分?jǐn)?shù)值明顯升高。與此同時(shí)，注射MSU 48 h后大鼠踝關(guān)節(jié)TRAP陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)量也比對(duì)照組明顯增加(P<0.01)。與MGA組比較，給予0.3 mg·kg-1秋水仙堿、丹皮酚(100、200 mg·kg-1)治療則明顯降低了MGA大鼠組織學(xué)評(píng)分和TRAP陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)(P<0.05或P<0.01)，且呈劑量依賴(lài)性；但給予50 mg·kg-1丹皮酚治療對(duì)MGA大鼠組織學(xué)評(píng)分和TRAP陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)均無(wú)明顯影響。

3.3丹皮酚對(duì)MGA大鼠關(guān)節(jié)組織TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)的影響如Tab 3、Fig 2所示，與對(duì)照組相比，注射MSU 48 h后大鼠關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)均明顯升高(P<0.01)。與MGA組相比，給予0.3 mg·kg-1秋水仙堿、丹皮酚(100、200 mg·kg-1)治療明顯降低了MGA大鼠關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)，且呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性(P<0.05或P<0.01)；但給予50 mg·kg-1丹皮酚治療對(duì)MGA大鼠關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)無(wú)明顯影響。

Tab 2 Effects of paeonol on gait score, histological score and osteoclast formation in MGA rats n=10)

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsMGA

Tab 1 Effect of paeonol on paw swelling in MGA rats n=10)

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsMGA

Fig 1 Effect of paeonol on histological damage and osteoclast formation in MGA rats (×100)

Fig 2 Effects of paeonol on expressions of TNF-α, IL-1β and IL-6 in ankle joints of MGA rats analyzed by immunohistochemistry staining (×200)

Tab 3 Effects of paeonol on levels of TNF-α, IL-1β, IL-6, p65 and IκBα in MGA rats

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsMGA

3.4丹皮酚對(duì)MGA大鼠關(guān)節(jié)滑膜p65和IκBα蛋白水平的影響如Tab 3、Fig 3所示，與對(duì)照組相比，注射MSU 48 h后大鼠關(guān)節(jié)滑膜中p65蛋白水平明顯升高，IκBα蛋白水平則明顯降低(P<0.01)。與MGA組相比，給予0.3 mg·kg-1秋水仙堿、丹皮酚(100、200 mg·kg-1)治療明顯提高了MGA大鼠關(guān)節(jié)滑膜中IκBα蛋白水平(P<0.05)；但給予50 mg·kg-1丹皮酚治療對(duì)MGA大鼠關(guān)節(jié)滑膜IκBα蛋白水平無(wú)明顯影響。同時(shí)，本研究中不同劑量的丹皮酚對(duì)MGA大鼠關(guān)節(jié)滑膜中p65蛋白水平均無(wú)明顯影響。

Fig 3 Effects of paeonol on levels of p65 and IκBα in synovium of MGA rats n=3)

4 討論

本研究應(yīng)用大鼠MGA模型，證實(shí)了丹皮酚(100、200 mg·kg-1)可明顯減輕大鼠足腫脹，改善步態(tài)評(píng)分、組織學(xué)評(píng)分和破骨細(xì)胞形成，降低關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)，提高IκBα蛋白水平，但對(duì)p65蛋白水平無(wú)明顯影響。

由于近幾十年痛風(fēng)發(fā)病率明顯上升，MSU誘導(dǎo)痛風(fēng)炎癥發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制逐漸成為研究熱點(diǎn)。MSU被證實(shí)是最強(qiáng)有力的促炎信號(hào)之一，其可激活巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、滑膜成纖維細(xì)胞等表達(dá)促炎細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子和組織蛋白酶，啟動(dòng)痛風(fēng)炎癥的發(fā)生、發(fā)展和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的病理?yè)p傷[9]。因此，通過(guò)向?qū)嶒?yàn)動(dòng)物關(guān)節(jié)腔注射MSU誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎癥(MGA模型)已成為國(guó)內(nèi)外廣泛認(rèn)同和使用的痛風(fēng)動(dòng)物模型[10]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MSU后6 h就快速誘導(dǎo)了大鼠關(guān)節(jié)腫脹，12 h關(guān)節(jié)腫脹達(dá)到峰值，注射后48 h關(guān)節(jié)腫脹仍然明顯，這一結(jié)果與Silva等[20]研究結(jié)論相一致。MSU注射后的步態(tài)評(píng)分和病理評(píng)分均明顯升高，提示MSU導(dǎo)致了關(guān)節(jié)功能障礙和組織病理?yè)p傷。給予丹皮酚治療后，關(guān)節(jié)腫脹明顯減輕，步態(tài)評(píng)分和病理評(píng)分均明顯降低。破骨細(xì)胞是介導(dǎo)炎癥狀態(tài)下關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞的主要效應(yīng)細(xì)胞，這一結(jié)論在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎等疾病中均得到證實(shí)[11]。本研究中，我們應(yīng)用TRAP染色法觀察到MSU誘導(dǎo)激活了大量破骨細(xì)胞，而丹皮酚治療后激活的破骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少。綜合上述結(jié)果表明，丹皮酚緩解了MSU誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎癥狀，改善了關(guān)節(jié)功能障礙和關(guān)節(jié)病理?yè)p傷，提示丹皮酚有抗大鼠MGA的藥理作用。

由于炎癥因子在痛風(fēng)炎癥發(fā)生、發(fā)展中扮演著關(guān)鍵角色，在初步證實(shí)了丹皮酚抗大鼠MGA發(fā)展的基礎(chǔ)上，我們接著探討了丹皮酚對(duì)MGA大鼠炎癥因子表達(dá)的影響。眾多的炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6均在痛風(fēng)炎癥發(fā)展中起了關(guān)鍵作用，其中尤以IL-1β的作用備受關(guān)注[9]。IL-1β既可刺激多種炎性細(xì)胞表達(dá)趨化因子、黏附分子和其它促炎細(xì)胞因子，也可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活化而導(dǎo)致關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的病理?yè)p傷，還可作用于神經(jīng)元，導(dǎo)致痛風(fēng)患者對(duì)炎癥疼痛過(guò)度敏感?？扇苄訧L-1誘餌受體列洛西普、IL-1β單克隆抗體卡那單抗均表現(xiàn)出優(yōu)異的抗痛風(fēng)療效，更加凸顯了IL-1β在痛風(fēng)炎癥病理過(guò)程中的核心地位[12]。本研究中，我們首先觀察到MGA大鼠病變關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)均明顯升高，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，也再次證明了炎癥因子在MGA發(fā)展中的核心作用[3]。以往的研究已經(jīng)證實(shí)了經(jīng)典抗痛風(fēng)藥物秋水仙堿對(duì)MSU誘導(dǎo)的多種炎性介質(zhì)表達(dá)有抑制作用[13]。本研究中，我們也觀察到秋水仙堿明顯降低了MGA大鼠病變關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)。給予丹皮酚治療后，MGA大鼠病變關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)都明顯降低，提示丹皮酚抗大鼠MGA的藥理作用與拮抗炎癥因子的表達(dá)密切相關(guān)。

已有的研究結(jié)果提示，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是MSU誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)的核心機(jī)制之一。MSU可直接結(jié)合TLR-2和TLR-4，通過(guò)多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)IκBα的泛素化降解，使得p65蛋白游離并核轉(zhuǎn)移，從而增加炎性細(xì)胞因子、黏附分子、趨化因子、組織蛋白酶等基因表達(dá)，促進(jìn)痛風(fēng)炎癥的發(fā)生、發(fā)展和關(guān)節(jié)組織的病理?yè)p傷[3]。與此同時(shí)，研究人員還發(fā)現(xiàn)了MSU誘導(dǎo)NF-κB活化的另一個(gè)機(jī)制。MSU 晶體可被單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等吞噬進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，通過(guò)鉀離子流出、活性氧或者溶酶體損傷等機(jī)制，激活細(xì)胞質(zhì)中的NALP3炎性體復(fù)合體，然后活化caspase-1，促進(jìn)前體IL-1β剪切成為成熟體IL-1β并分泌至細(xì)胞外[14]。胞外的IL-1β通過(guò)與炎性細(xì)胞胞膜上相應(yīng)受體結(jié)合，激活NF-κB，最終促進(jìn)痛風(fēng)炎癥的發(fā)展。因此，我們?cè)谧C實(shí)了丹皮酚抑制MGA大鼠炎癥因子表達(dá)的基礎(chǔ)上，觀察了丹皮酚對(duì)MSU誘導(dǎo)的NF-κB活化的影響。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MGA大鼠病變關(guān)節(jié)組織中IκBα水平明顯降低，提示MSU誘導(dǎo)了IκBα降解，從而促進(jìn)了NF-κB活化。給予丹皮酚治療后，MGA大鼠病變關(guān)節(jié)組織中IκBα水平明顯增高，提示丹皮酚阻遏了MSU誘導(dǎo)的IκBα降解，提高了組織中IκBα水平，從而抑制了NF-κB活化。有意思的是，我們發(fā)現(xiàn)丹皮酚對(duì)MGA大鼠關(guān)節(jié)組織中p65蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯影響，提示丹皮酚抑制NF-κB活化的藥理作用主要是通過(guò)阻斷其活化的信號(hào)途徑，而非影響其表達(dá)量而實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，本研究證實(shí)了丹皮酚可明顯抑制大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，其機(jī)制與抑制關(guān)節(jié)組織中NF-κB活化，從而降低炎性介質(zhì)表達(dá)密切相關(guān)。本研究為中醫(yī)臨床應(yīng)用中藥牡丹皮治療痛風(fēng)的科學(xué)性提供了證據(jù)，也為利用丹皮酚研發(fā)新的抗痛風(fēng)藥物提供了初步的藥理實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在重慶工商大學(xué)重慶市天然藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝孔淑貞博士、殷鐘意高級(jí)實(shí)驗(yàn)師給予的技術(shù)支持。)