季宇彬，董婉睿,，劉雪松,，王 敏，丁世蘭，杜玉洋，楊勇述，徐萬雷，劉朝斌，李才汪，孫桂波，孫曉波

(1. 哈爾濱商業(yè)大學生命科學與環(huán)境科學研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國醫(yī)學科學院，北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所藥理毒理中心，北京 100193；3. 云南省彝良縣天麻產業(yè)開發(fā)辦公室，云南 昭通 657600)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)又稱老年性癡呆，是一種嚴重的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，其臨床表現(xiàn)為進行性的認知功能減退或障礙[1]。隨著人口老齡化傾向，該病發(fā)病率有增高趨勢，嚴重影響了人類的身心健康及生活質量。

天麻(GastrodiaelataBl.)為蘭科天麻屬植物，是我國名貴中藥材，具有息風、定驚，治眩暈眼黑、頭風頭痛、肢體麻木、止痙等功效。近年來的臨床研究表明，天麻能改善AD患者的學習記憶功能，具有提高患者生活能力的作用[2]。小草壩天麻是云南省昭通市彝良縣小草壩鎮(zhèn)的特產，其品質優(yōu)良，藥用價值高。且據分析檢測，彝良小草壩天麻的天麻素、無機元素和氨基酸含量明顯優(yōu)于省外主要產地的天麻[3]。據報道，東莨菪堿所致學習記憶障礙模型被認為是AD藥物研究經典的初篩模型[4]。為了探究小草壩天麻對AD的功效與作用，本文采用東莨菪堿建立小鼠記憶獲得障礙模型，通過行為學實驗觀察天麻提取物對小鼠學習記憶的影響，并測定腦組織、海馬組織及皮層組織中的乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AchE)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量，初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組實驗采用SPF級ICR小鼠135只，♂，體質量(22±2)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供(實驗動物合格證編號：No.11400700227833)，隨機分為6組(每組15只)：空白組及模型組分別以超純水灌胃，每只0.2 mL；陽性藥石杉堿甲組以石杉堿甲0.08 mg·kg-1·d-1灌胃；小草壩天麻水提物低、中、高劑量組分別以10、20、40 mg·kg-1·d-1灌胃，連續(xù)15 d進行預防性給藥。后進行為期4 d的水迷宮學習訓練。學習結束后，正式進行5 d水迷宮定位航行實驗，1 d水迷宮空間探索實驗。

1.2藥物與試劑小草壩天麻購于云南省彝良縣，天麻水提物由北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所化學中心提供；東莨菪堿標準品(貨號：BWB50313)、石杉堿甲中藥對照品(批號：07041114)，由北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院提供；考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒 (批號:20170908)、AChE測試盒(批號:20170825)、MDA測試盒(批號：20170919)、SOD測試盒(批號：20170922)，均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3儀器Morris水迷宮(直徑100 cm,水深50 cm,安全平臺直徑9 cm)及視頻分析系統(tǒng)，由中國醫(yī)學科學院藥物研究所提供，型號DMS-2；離心機(深圳安科高技術股份有限公司); 酶標儀(美國Bio-Tek)；高通量組織研磨儀(北京鼎昊源科技有限公司)。

1.4方法

1.4.1水迷宮篩選 小鼠進行水迷宮篩選前，先將小鼠放在平臺上20 s，讓其認知平臺，然后將小鼠從平臺對角象限頭朝水迷宮內壁放入水中，觀察其2 min內能否找到平臺，能找到平臺的納入正式實驗，不能找到平臺的小鼠人為將其引導上平臺停留20 s，10 min后進行第2次篩選實驗，能找到的納入正式實驗，兩次都不能找到平臺的小鼠剔除出實驗。

1.4.2水迷宮訓練 將篩選合格的小鼠進行4 d水迷宮訓練實驗，訓練實驗同篩選實驗方法，如此連續(xù)訓練10次，確保每只小鼠都能在規(guī)定的時間內找到平臺。訓練期間按相應劑量給藥。

1.4.3小鼠定位航行實驗 水迷宮實驗周期為6 d，定位航行實驗周期為5 d，正常給藥后，在水迷宮實驗小鼠入水前20 min，一次性腹腔注射東莨菪堿3 mg·kg-1，復制小鼠學習記憶獲得障礙模型，空白組小鼠注射相應劑量無菌生理鹽水。自動記錄小鼠第1次找到隱匿平臺時間(逃避潛伏期)等各項指標。

1.4.4小鼠空間探索實驗 空間探索實驗周期為1 d，實驗時不給藥，僅在小鼠入水前20 min進行記憶障礙模型造模。移去平臺，自動記錄第1次到達原平臺所在位置時間和跨越平臺次數，時間為120 s。水迷宮注意事項：平臺低于水面1 cm，水溫(25.0±1.0)℃，實驗期間迷宮外參照物保持不變。

1.5小鼠組織制備及生化指標測定

1.5.1腦組織勻漿的制備 水迷宮實驗結束后，將小鼠處死，取出腦組織，分離每組小鼠大腦皮質和海馬，置于離心管中，-80℃冷凍保存。制備勻漿時，取約100 mg組織，加入9倍量0.9%氯化鈉溶液，置EP管中，并放入鋼珠，于高通量組織研磨儀中充分研磨，制成10%腦組織勻漿，3 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液備用。

1.5.2腦組織蛋白含量測定 取10%腦組織勻漿液100 μL，按考馬斯亮藍蛋白測定測試盒說明書操作步驟和計算公式，酶標儀在 595 nm波長處比色，測定海馬組織及皮層組織蛋白濃度，以此作為小鼠腦組織蛋白定量。

1.5.3腦組織AChE活力測定 取10%海馬及皮層組織勻漿液各40 μL，按AChE測試盒說明書，酶標儀在412 nm波長處比色，測定海馬組織及皮層組織勻漿中 AChE活力。

1.5.4腦組織SOD活力測定 取10%海馬及皮層組織勻漿液各20 μL，按SOD測定試劑盒說明書，酶標儀在450 nm波長處比色，測定海馬組織及皮層組織勻漿中SOD活力。

1.5.5腦組織MDA含量測定 取10%海馬及皮層組織勻漿液各20 μL，按MDA測試盒說明書，酶標儀在532 nm波長處比色，測定海馬組織及皮層組織勻漿中MDA含量。

2 結果

2.1天麻對小鼠定位航行實驗的影響Fig 1的定位航行實驗路徑圖結果顯示，與空白組相比，模型組小鼠尋找平臺所需的時間明顯增多，說明記憶障礙模型造模成功。石杉堿甲組和天麻組與模型組相比，尋找平臺所需時間明顯減少。

Fig 1 Comparison of path diagramsfor positioning navigation experiments

2.2天麻水提物對小鼠空間探索實驗的影響Fig 2的水迷宮空間探索實驗路徑圖結果顯示，與空白組相比，模型組小鼠在目標象限占比沒有明顯趨勢；與模型組相比，石杉堿甲組和天麻組在目標象限時間占比明顯增多，小鼠更趨向于目標象限。

Fig 2 Comparison of path diagramsfor positioning sailing experiment

空間探索實驗潛伏期、小鼠在目標象限時間及路程見Fig 3。結果顯示，對潛伏期而言，模型組小鼠潛伏期相比空白組更長，即模型組第1次找到平臺花費的時間要比空白組更多(P<0.05)；天麻組相比于模型組，其潛伏期短，其中高劑量組差異有顯著性(P<0.01)。對目標象限時間而言，模型組小鼠在目標象限所處的時間相比空白組更少(P<0.01)，石杉堿甲組差異也有顯著性(P<0.01)；相比于模型組，天麻組在目標象限所處時間更長，中、高劑量組差異有顯著性(P<0.05)。同理，對目標象限路程而言，模型組目標象限路程相比于空白對照組更短(P<0.05)；相比模型組，石杉堿甲組目標象限路程明顯增加(P<0.05)，天麻組中劑量差異具有顯著性(P<0.05)。

2.3天麻水提物對小鼠AchE活性的影響海馬組織和皮層組織AchE活力測定結果見Fig 4。海馬組織和皮層組織模型組的AchE活力相比于空白組均有明顯的升高(P<0.01)。海馬組織中，與模型組相比，小草壩天麻AchE活力明顯降低(P<0.05)；皮層組織中，與模型組相比，低劑量組AchE含量明顯降低(P<0.01)。

2.4天麻水提物對小鼠SOD含量的影響海馬組織和皮層組織SOD活力測定結果見Tab 1。相比于對照組，皮層組織模型組的SOD活力明顯降低(P<0.05)；天麻給藥組SOD活力與模型組相比明顯升高(P<0.05，P<0.01)。海馬組織SOD活力組間差異無顯著性。

2.5天麻水提物對小鼠MDA含量的影響海馬組織和皮層組織MDA活力測定結果見Tab 2。模型組海馬組織中MDA含量相比于對照組明顯升高；天麻給藥組海馬組織中MDA活力與模型組相比明顯降低(P<0.01)。皮層組織中MDA含量組間差異無顯著性。

Fig 3 Result of space exploration

3 討論

AD早期會出現(xiàn)輕度膽堿能功能障礙，膽堿能系統(tǒng)活性降低的程度也與認知功能障礙的程度有關。因此，研究膽堿能系統(tǒng)對記憶的影響，以及利用現(xiàn)有的藥理學工具對繼發(fā)性功能障礙恢復也是至關重要的[5]。訓練前，由東莨菪堿所致的膽堿能阻滯可以導致順行記憶障礙，學習記憶受損[6]。東莨菪堿誘導的記憶障礙可作為老年記憶障礙和AD記憶障礙的模型，是抗AD藥物實驗研究中常用的造模藥物之一[7]。而天麻對于改善記憶、延緩衰老、增強免疫力等方面臨床應用效果明顯[8]。通過研究東莨菪堿記憶障礙模型，評價彝良小草壩烏天麻對動物學習記憶的影響，結果表明，小草壩烏天麻可明顯改善小鼠的學習記憶能力；另外，還發(fā)現(xiàn)天麻的作用機制可能與抑制AchE活性有關。本實驗結果與韓春妮等[2]通過采用Hestrin堿性羥胺比色法，根據組織濕重計算乙酰膽堿含量測定天麻提取物對記憶獲得障礙模型小鼠影響所得結果一致。

Fig 4 Result of AchE activity in hippocampal

Tab 1 Result of SOD activity inhippocampal and cortical

*P<0.05,**P<0.01vsmodel;#P<0.05vscontrol

Tab 2 Result of MDA levels in hippocampal

**P<0.01vsmodel;##P<0.01vscontrol

海馬是人類和其他哺乳動物前腦膽堿能系統(tǒng)的重要區(qū)域，在空間導向和鞏固長期記憶中起著重要作用[9]。而記憶的鞏固依賴于神經遞質系統(tǒng)的調節(jié)，其中，中樞膽堿能系統(tǒng)參與了主要的學習和記憶的過程。據報道，AD患者的一個重要特征表現(xiàn)是乙酰膽堿(Ach)含量降低，AChE活力升高[10]。本實驗還發(fā)現(xiàn)，天麻另外的作用機制有可能通過增強SOD活力及降低MDA含量實現(xiàn)。另外，相比明建等[11]的研究，本實驗進一步探索了小草壩天麻水提物的作用機制。本實驗在考察Ach和MDA含量的同時，還考察了SOD含量，目的是確證小草壩天麻是否對抗氧化能力有一定的作用。從實驗結果可以看出，小草壩天麻改善學習記憶能力可能與一定程度上增強小鼠的抗氧化能力有關。

本實驗側重于評價彝良小草壩烏天麻的道地性，選用了道地藥材彝良小草壩烏天麻作為受試藥物來源。與劉智慧等[12]選用天麻素等單體進行實驗相比，本實驗使用了天麻水提物，著重凸顯天麻整體的作用與藥效。實驗結果發(fā)現(xiàn)，小草壩天麻在改善小鼠學習記憶方面有較好的作用，這為提升彝良小草壩烏天麻的道地藥材價值提供了可靠的依據。

綜上所述，本研究比較了不同劑量的天麻水提物在東莨菪堿導致的學習記憶障礙模型中的作用，并分析了其可能作用機制。另外，天麻的鎮(zhèn)靜、抗衰老等作用具體作用通路還未見報道，進一步的研究還可從深入探討天麻對記憶障礙影響的機制入手，確證其信號通路。同時，也可考慮使用其他行為學方法來考察相關指標，進一步研究天麻的作用機制，為天麻的藥理藥效提供更多的實驗依據。

(致謝：本實驗于中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所藥理毒理中心實驗室完成，感謝所有參與實驗的老師及同學們！)