郝艷玲，薛 敏，孫 紅，曾曉榮

(徐州醫(yī)科大學1.基礎醫(yī)學國家級實驗教學示范中心機能實驗分中心、2.生理教研室，江蘇 徐州 221004；3.西南醫(yī)科大學醫(yī)學電生理學教育部重點實驗室心血管醫(yī)學研究所，四川 瀘州 646000)

近年來，銀杏葉提取物對心腦血管循環(huán)系統(tǒng)有改善作用已有較多報道。雖然銀杏葉提取物中的活性成分很多，但在拮抗血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)方面，它的活性成分中的銀杏內酯A、B、C是PAF天然的特異性拮抗劑[1]。一般缺血預處理只能起到預防作用，而缺血后處理卻能起到治療作用，且藥物性缺血后處理，相對于手術的風險小，因而有著更好的臨床應用價值。研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內酯A預處理，可改善成年大鼠離體心臟缺血狀態(tài)[2]，缺血性心肌病是老年人的好發(fā)病，目前研究表明，銀杏內酯A后處理，對老年大鼠心功能的影響，尤其是對缺血的單個心肌細胞收縮功能的研究甚少。因而，本實驗通過使用銀杏內酯A后處理的方式，研究其對缺血/再灌注損傷的老年大鼠單個心肌細胞收縮功能的影響，并探究其發(fā)揮作用是否與PI3K/Akt信號通路有關。

1 材料與方法

1.1實驗動物正常健康清潔級SD老年大鼠，♂，20～24月齡，體質量(400±50)g，由徐州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK(蘇)2012-0032。

1.2試劑與儀器銀杏內酯A(德國Fluka公司)，溶于二甲基亞砜(DMSO)中[3]；LY294002(Sigma公司，批號：092M4616V)；Ⅱ型膠原酶(Gibco公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)；蛋白提取試劑盒、NBT/NCIP顯色試劑盒(碧云天生物技術公司)；p-Akt、Bcl-2、Bax一抗(Cell Signaling公司)；其他試劑均為國產分析純。Langendorff灌注裝置(澳大利亞AD Instrument)；酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3分離單個心肌細胞參照實驗室常用的方法[3]，SD老年大鼠腹腔注射肝素約10 min后，頸椎脫臼處死，取出心臟置冰浴臺氏液中，剪去除主動脈以外心臟周圍其他的組織，并把主動脈插入Langendorff灌注架上，用線結扎固定。用無鈣臺氏液灌5 min，接著改用含0.5 g·L-1Ⅱ型膠原酶和鈣的臺氏液循環(huán)灌流25 min左右，待心臟變軟，迅速剪下左心室部分，置氧飽和的KB液中撕碎，過濾出單個心肌細胞，并讓其自然沉降，棄上清，用KB液洗滌沉淀3次后，接種于無血清高糖DMEM中，在12孔板中的濃度為2×104個細胞/孔，于CO2培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)2 h。

1.4細胞模擬缺血/再灌注模型的制備[3]隨機將分離的老年大鼠心肌細胞分為3組，正常對照組(Control組)：心肌細胞在CO2培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)5 h；缺血/再灌注損傷組(I/R組)：即模擬缺血/再灌注損傷，先將老年心肌細胞放置于無糖培養(yǎng)基中，并于三氣培養(yǎng)箱(37℃、94% N2、5% CO2和1% O2)培養(yǎng)3 h，之后放入CO2培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h視為模擬復灌；銀杏內酯A組(GA組)：將模擬缺血3 h后的老年單個心肌細胞放入加有銀杏內酯A的正常培養(yǎng)基中，正常培養(yǎng)2 h，GA組又分為5個濃度組(GA 0.1組、GA1組、GA10組、GA30組、GA100組)，其在培養(yǎng)基中的終濃度分別為0.1、1、10、30、100 μmol·L-1。采用盲法在顯微鏡下計數(shù)一定數(shù)量的心肌細胞，存活率/%=長桿狀細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。吸取少量心肌細胞測定其收縮功能，剩下用于測定蛋白含量。

1.5心肌細胞收縮功能測定[3]吸取少量心肌細胞，滴加在含有2 mmol·L-1鈣的KH液恒流(37℃)的細胞浴槽內，并給予0.5 Hz的電刺激。選取細胞膜完好、橫紋比較清晰、桿狀的心肌細胞(放大400倍)，記錄并分析其收縮情況。用Optical Measure軟件分析，計算心肌細胞收縮幅度(%)、收縮時間(time-to-peak，TTP)、舒張50%時間(R50)、舒張100%時間(R100)。并確定銀杏內酯A的最佳濃度。

1.6LDH和SOD含量的測定收集各組培養(yǎng)基上清，按試劑盒說明書測定LDH和SOD的釋放量，嚴格按照操作規(guī)程，使用酶標儀測定。

1.7Westernblot檢測細胞Bcl-2、Bax和p-Akt蛋白的表達由收縮功能確定的銀杏內酯A最佳濃度為30 μmol·L-1。LY組：在心肌細胞模擬缺血3 h后，即復灌開始時，細胞培養(yǎng)基中加入終濃度為20 nmol·L-1的LY294002(PI3K/Akt信號通路抑制劑)。GA+LY組：在復灌時，培養(yǎng)基中加入30 μmol·L-1的銀杏內酯A及與LY組相同濃度的LY294002。繼續(xù)正常培養(yǎng)2 h后，收集細胞，加入裂解液，離心取上清，用BCA法測定蛋白濃度，取蛋白樣品進行15% SDS-PAGE(10%分離膠，5%濃縮膠)電泳分離，并移至PVDF膜上，封閉2 h后，用p-Akt、Bcl-2、Bax一抗(1 ∶1 000)4℃孵育過夜，洗膜，二抗結合2 h，再洗膜，加入顯色劑(NBT/NCIP顯色試劑盒)，流水洗滌終止反應。內參對照用β-actin(1 ∶5 000)。定量分析，對照組光密度為1，其余組與其比較。結果重復3次。

2 結果

2.1心肌細胞存活率如Fig 1所示，與Control組比較，其余各組的心肌細胞存活率明顯下降(P<0.01)。但與I/R組相比，銀杏內酯A后處理后，能夠增加心肌細胞的存活率，在濃度為10、30 μmol·L-1時差異有顯著性(P<0.01)。

Fig 1 Effect of ginkgolide A post-treatment on viabilityof aged rat cardiomyocytes after I/R

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsI/R

2.2培養(yǎng)基中LDH的含量和SOD的活性Tab 1結果顯示，與Control組比較，其余各組細胞培養(yǎng)基中的LDH含量明顯增加；與I/R組比較，銀杏內酯A后處理以后，GA10、GA30組培養(yǎng)基中的LDH含量明顯降低(P<0.05)。與Control組比較，其余各組的SOD含量明顯下降；與I/R組比較，GA10、GA30組培養(yǎng)基中SOD的含量均明顯增加(P<0.01)。

Tab 1 Release of LDH and SOD in differentgroups′media after 2 h stimulated

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsI/R

2.3心肌細胞收縮功能

2.3.1心肌細胞收縮幅度變化 如Fig 2所示，與Control組比較，其余各組的心肌細胞收縮幅度明顯下降；與I/R組比較，銀杏內酯A后處理以后，GA10、GA30組心肌細胞的收縮幅度明顯增強(P<0.05)，而銀杏內酯A在低濃度和高濃度時，對心肌細胞的收縮幅度沒有影響。

Fig 2 Effect of ginkgolide A post-treatment on myocellularshortening amplitude in aged rats after I/R

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsI/R

2.3.2心肌細胞TTP、R50、R100變化 Tab 2結果顯示，與Control組比較，其余各組的TTP都明顯延長；與I/R組比較，GA10、GA30組TTP均明顯縮短(P<0.05)。與對照組的R50比較，I/R組的時間明顯延長，但與I/R組相比較，GA10組能明顯縮短R50(P<0.05)。而在舒張100%的時間中，各組間差異無顯著性。

Tab 2 Ginkgolide A post-treatment on changes of TTP,R50,R100 in cardiomyocytes suffered I/R n=10,ms)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsI/R

2.4銀杏內酯A后處理對I/R損傷的細胞中Bcl-2、Bax蛋白表達的影響如Fig 3所示，與Control組相比，I/R組心肌細胞中Bcl-2蛋白含量明顯下降，而Bax蛋白明顯升高。不同濃度的銀杏內酯A后處理后，Bcl-2蛋白含量卻有不同程度的升高，Bax蛋白表達也有相應的下降，Bax/Bcl-2也明顯下降。與I/R組相比，銀杏內酯A的濃度在10、30 μmol·L-1時，差異有顯著性(P<0.05)。

Fig 3 Ginkgoldie A post-treatment on changes of Bcl-2 and Baxproteins in stimulated ischemia aged rat

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsI/R

2.5銀杏內酯A后處理對I/R損傷的老年大鼠心肌細胞中Akt磷酸化水平的影響由Fig 4可看出，每個組Akt總蛋白表達(T-Akt)差異并無顯著性。但模擬I/R后，各組細胞中p-Akt蛋白表達升高，Akt磷酸化水平(p-Akt/Akt)增強。與Control組和I/R組相比，銀杏內酯A明顯提高了Akt磷酸化水平。聯(lián)合用LY294002后，銀杏內酯A提高Akt磷酸化水平的作用被部分抑制了(P<0.05)。提示銀杏內酯A后處理的這種保護作用可能與其激活PI3K/Akt信號通路有關。

Fig 4 Effect of ginkgolide A post-treatment on expression ofp-Akt and Akt proteins in I/R aged rat

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內酯A無論在體內，還是體外都能夠通過不同的通路來減弱炎癥反應[4-5]，有較好的抗炎作用，并能夠抑制各種早期炎癥介質。血小板活化因子受體(platelet activating factor receptor，PAFR)是G蛋白偶聯(lián)受體，它會出現(xiàn)在關鍵的靶細胞的炎癥、免疫和止血過程中。當PAFR與其配體PAF或像PAF一類的脂質結合以后，就會引發(fā)各種細胞內的信號級聯(lián)反應，并誘導一些功能變化，然后啟動或放大炎癥反應，形成血栓或最終凋亡。在缺血或缺氧組織中，PAF的積累是一個主要的損傷因素，PAF參與了心肌再灌注損傷過程。

研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內酯A后處理以后能夠增強老年大鼠心肌細胞的存活率，濃度在10、30 μmol·L-1時能發(fā)揮更好的保護作用，證明了銀杏內酯A起到了降低細胞損傷的作用。有研究發(fā)現(xiàn)[6]，5 μg·L-1的銀杏內酯就能夠明顯降低心肌細胞的死亡率，在缺氧的心肌細胞中PAFR的mRNA表達增加，而銀杏內酯卻能降低其表達。在缺血階段，銀杏內酯能夠調節(jié)PAFR以及PAF的乙酰水解酶，抑制和減弱心肌梗死，從而對缺血心臟起到保護作用。銀杏內酯A降低老年心肌細胞凋亡是否通過調節(jié)PAFR mRNA的表達而起保護作用的，有待進一步研究。

另外，銀杏內酯A還降低了培養(yǎng)基中LDH的含量，抑制了SOD活性的下降，說明其可對抗因氧自由基對細胞造成的損害，并及時修復受損細胞，減弱由自由基對細胞造成的傷害。這是由于銀杏內酯A具有明顯的抗氧化和自由基清除的作用[7]。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，由于缺血造成的負性肌力作用可以被銀杏內酯A后處理抑制，銀杏內酯A濃度在10、30 μmol·L-1時能夠有效抑制由缺血造成的單個心肌細胞收縮幅度的降低，并呈濃度依賴的方式。心肌細胞的收縮功能受收縮和舒張兩方面的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在缺血/再灌注損傷以后，TTP明顯延長，說明缺血/再灌注損傷減弱了心肌細胞的收縮能力。而銀杏內酯A后處理以后，明顯地縮短了缺血造成的TTP的延長，增強了細胞的收縮力，縮短了R50，使得心肌細胞盡快恢復。但各組間R100沒有差異，表明銀杏內酯A并不能改變舒張時間，有助于心肌細胞更好地休息。這與之前在離體器官水平上，銀杏內酯A預處理改善成年大鼠缺血/再灌注損傷的離體心臟收縮功能[2]的結果相一致。銀杏內酯B對缺血后心肌細胞的收縮有改善作用，并減輕再灌注損傷[3]，可能與它調控一些鈣調蛋白有關[8]。銀杏內酯A后處理減輕老年大鼠的再灌注心肌損傷是否也通過這些機制，有待進一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內酯A后處理能夠增加老年大鼠心肌細胞中p-Akt的表達，而LY294002能消弱這種作用，降低Bax/Bcl-2，減少了細胞死亡率。PI3K/Akt信號通路中Akt磷酸化降低后，一些促炎癥因子表達會增強，并最終誘導心肌細胞凋亡[9]。Akt一旦被激活，可以使Bcl-2蛋白表達增強，并能夠進一步抑制促凋亡蛋白如Bax、Bad、caspase等的形成。Bcl-2家族是PI3K/Akt信號通路的重要靶點，細胞的凋亡取決于Bax/Bcl-2，比值越高死亡率越高[10]。 因而，銀杏內酯A對老年大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護作用，可能是通過影響PI3K/Akt信號通路，降低細胞凋亡來完成的，與銀杏內酯B的作用機制相同[11]，是否可以考慮聯(lián)合應用兩種成分來治療老年心肌缺血病，或許效果會更佳。

研究結果表明，銀杏內酯A后處理對老年大鼠缺血/再灌注損傷造成的單個心肌細胞收縮功能障礙，具有改善作用，能夠減少心肌細胞的凋亡，可能是通過PI3K/Akt信號通路完成的。因而，銀杏內酯A后處理對老年人的心肌缺血病具有潛在的臨床治療作用。

(致謝：感謝徐州醫(yī)科大學生理功能與損傷實驗室為本實驗提供的技術支持，感謝付璐、潘秀華老師和侯紅件給予實驗上的幫助。)