羅春華 林 云 賀 崢 申九妹 王 靜 鄭啟忠

（北京中醫(yī)藥大學(xué)廈門醫(yī)院病理科，福建 廈門 361009）

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，占甲狀腺惡性腫瘤的80%～85%[1]。PTC是一個(gè)具有很高治愈率和良好預(yù)后的惡性腫瘤，其10年疾病總生存率超過90.0%[2]，但近年來其發(fā)病率逐年上升，難治性甲狀腺癌的患者數(shù)量亦逐漸增多，甚至部分患者死于轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[3-9]。因此，研究預(yù)測PTC轉(zhuǎn)移及預(yù)后的分子標(biāo)志物是PTC研究的重要課題。本研究采用熒光PCR法檢測PTC組織中BRAF V600E 和TERT 啟動(dòng)子的突變情況，分析其與PTC 患者臨床病理特征之間的關(guān)系，進(jìn)一步明確BRAF V600E 和TERT 啟動(dòng)子突變對(duì)PTC 患者預(yù)后評(píng)估的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 患者和組織樣本：選取2015年1月至2017年12月在北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬廈門醫(yī)院及廈門市第三人民醫(yī)院外科手術(shù)切除的248例10%中性福爾馬林固定石蠟包埋的PTC標(biāo)本，所有標(biāo)本均按照樣本倫理道德規(guī)范及匿名處理。

1.2 主要設(shè)備與試劑：主要設(shè)備包括StepOne實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（美國Applied-Biosystems公司），OD-2000TM超微量分光光度計(jì)（美國Thermo Scientific公司）。主要試劑包括石蠟切片樣品DNA提取試劑盒（型號(hào)：FFPE DNA，Cat NO.ADx-FF01）、人BRAF基因V600E突變檢測（熒光PCR法）試劑盒（貨號(hào)：ADx-BR01、ADx-BR02）以及人TERT基因啟動(dòng)子突變檢測（PCR-熒光探針法）試劑盒（貨號(hào)：RPQ008）。

1.3 樣品DNA提取及質(zhì)檢：按石蠟切片樣本DNA提取試劑盒（ADx-FF01）說明進(jìn)行樣品DNA提取，在OD-2000TM超微量分光光度計(jì)上檢測所提DNA的質(zhì)量，并將DNA模板濃度標(biāo)化至2.0 ng/μL。

1.4 熒光PCR法檢測BRAF V600E突變：按人BRAF基因V600E突變檢測試劑盒說明進(jìn)行BRAF基因突變檢測。每一PCR反應(yīng)板均設(shè)陽性質(zhì)控與陰性對(duì)照。結(jié)果判讀：嚴(yán)格按試劑盒提供的判讀標(biāo)準(zhǔn)確定標(biāo)本BRAF V600E突變狀態(tài)，滿足以下3點(diǎn)可認(rèn)為檢測成功：①待測樣本和陽性質(zhì)控的內(nèi)控信號(hào)升起；②陰性對(duì)照內(nèi)控信號(hào)和外控信號(hào)均無升起；③陽性質(zhì)控的外控信號(hào)Ct值＜20。BRAFV600E突變結(jié)果判斷：①待測樣本外控信號(hào)的Ct值≥28，為BRAF V600E未突變；②待測樣本Ct值＜28則認(rèn)為BRAF V600E突變。

1.5 熒光PCR法檢測TERT啟動(dòng)子C228T及C250T突變：按人TERT基因啟動(dòng)子突變檢測試劑盒說明進(jìn)行TERT C228T及C250T突變檢測。每一PCR反應(yīng)板均設(shè)陽性質(zhì)控與陰性對(duì)照。結(jié)果判讀：以RPQ008TERT試劑盒提供的判讀標(biāo)準(zhǔn)確定標(biāo)本TERT啟動(dòng)子C228T及C250T突變狀態(tài)，滿足以下3點(diǎn)則認(rèn)為檢測成功：①待測樣本和陽性質(zhì)控的內(nèi)控信號(hào)升起；②陰性對(duì)照內(nèi)控信號(hào)和外控信號(hào)均無升起；③陽性質(zhì)控的外控信號(hào)Ct值＜14。TERT突變判定標(biāo)準(zhǔn)：①待測樣本外控信號(hào)的Ct值＞25為未突變；②待測樣本Ct值＜25則為有突變。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS19統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料的兩兩比較用χ2分析，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 熒光PCR法檢測BRAF V600E突變及TERT啟動(dòng)子突變的質(zhì)量控制：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示所有樣本均能有效提取和純化DNA，A260/A280均在1.8～2.0，且A260/A230＞2.0，符合熒光PCR法的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。采用熒光PCR法檢測BRAFV600E突變的結(jié)果顯示：陽性質(zhì)控的PCR擴(kuò)增曲線均見升起、且外控信號(hào)Ct值＜20，陰性對(duì)照無外控信號(hào)升起，所有待測樣本的內(nèi)控信號(hào)均見升起，提示檢測成功（圖1）。采用熒光PCR法檢測TERTC280T及C250T突變的結(jié)果顯示：陽性質(zhì)控的PCR擴(kuò)增曲線均見升起、且外控信號(hào)Ct值＜14，陰性對(duì)照無外控信號(hào)升起，所有待測樣本內(nèi)控信號(hào)均見升起，提示檢測成功（圖2）。

圖1 熒光PCR法檢測BRAF V600E突變。A：BRAF V600E突變陽性；B：BRAF V600E突變突變陰性

圖2 熒光PCR法檢測TERT啟動(dòng)子突變。A：TERT啟動(dòng)子突變陽性；B：TERT啟動(dòng)子突變陰性

2.2 BRAF V 600E 突變與PTC患者臨床病理特征的關(guān)系：本組病例中甲狀腺乳頭狀癌BRAF V600E 基因突變率為78.6%（195/248）。BRAF V600E突變與PTC患者性別（χ2=0.968，P=0.325）、年齡（χ2=1.538，P=0.215）、腫瘤大?。é?=0.163，P=0.686）、腫瘤單側(cè)或雙側(cè)累及（χ2=0.997，P=0.318）、腫瘤侵犯至甲狀腺被膜外或局限在甲狀腺內(nèi)（χ2=0.597，P=0.44）以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=1.78，P=0.186）等臨床病理特征均無關(guān)（P值均＞0.05，表1），提示BRAF V600E與PTC患者預(yù)后無關(guān)。

2.3 TERT 啟動(dòng)子突變與PTC患者臨床病理特征的關(guān)系：本組病例中PTC 患者TERT 啟動(dòng)子突變率為7.66%（19/248），其中TERT C228T 位點(diǎn)突變率為6.85%（17/248），TERT C250T 位點(diǎn)突變率為0.81%（2/248）。TERT啟動(dòng)子突變與PTC患者性別（χ2=0.171，P=0.679）及腫瘤單側(cè)或雙側(cè)累及（χ2=0.476，P=0.49）無關(guān)（P值均＞0.05，表1）；與患者年齡（χ2=5.635，P=0.018）、腫瘤大?。é?=5.001，P=0.025）、腫瘤侵犯至甲狀腺被膜外或局限在甲狀腺內(nèi)（χ2=131.92，P=0.000）以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=5.457，P=0.019）等臨床病理特征均有關(guān)（P值均＜0.05，表1），提示TERT啟動(dòng)子突變與PTC患者預(yù)后相關(guān)。

2.4 僅BRAF突變或僅TERT 突變或二者同時(shí)突變與PTC患者臨床病理特征的關(guān)系：PTC 患者BRAF V600E突變195例，TERT 啟動(dòng)子突變19例，其中10例同時(shí)伴有BRAF V600E突變及TERT啟動(dòng)子突變。僅BRAF V600E突變組與PTC患者臨床病理特征無關(guān)（P值均＞0.05，表2）；僅TERT突變組與PTC患者性別及是否雙側(cè)侵犯無關(guān)（P值均＞0.05，表2），與患者年齡、腫瘤大小、腺外侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P值均＜0.05，表2）；BRAF 和TERT 同時(shí)突變亦表現(xiàn)出與PTC 患者年齡、腫瘤大小、腺外侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P值均＜0.05，表2），而與性別、是否雙側(cè)累及均無關(guān)（P值均＞ 0.05，表2），提示TERT 啟動(dòng)子突變與PTC患者預(yù)后相關(guān)，是否同時(shí)發(fā)生BRAF V600E突變對(duì)患者預(yù)后影響無明顯意義。

3 討 論

PTC 是常見的甲狀腺惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多基因參與的過程。因此，探尋PTC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵基因既有利于PTC的早期診斷與合理治療，也有利于更好的理解常規(guī)治療無效的原因。

目前研究表明，BRAF V600E基因突變是PTC經(jīng)典DNA相關(guān)標(biāo)志物，廣泛參與PTC的發(fā)生、發(fā)展過程。然而，BRAF V600E 突變是否對(duì)PTC 患者預(yù)后產(chǎn)生影響，多年來的研究仍未得出一致的觀點(diǎn)。Virk等[10]認(rèn)為BRAF V600E突變是區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立預(yù)測因素；Lang等[11]的研究提示，BRAFV600E突變與腫瘤大小、腫瘤腺外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。但是，近年來的研究認(rèn)為BRAF V600E突變與PTC生物學(xué)行為并無明顯關(guān)系，Pelttari等[12]的研究結(jié)果顯示BRAF V600E突變與性別、年齡、腫瘤大小、腺外侵犯和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無顯著相關(guān)性。本研究結(jié)果中甲狀腺乳頭狀癌BRAF V600E 基因突變與PTC患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤單側(cè)或雙側(cè)累及、腫瘤侵犯至甲狀腺被膜外或局限在甲狀腺內(nèi)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征均無關(guān)，提示BRAF V600E與PTC患者預(yù)后無關(guān)。

有研究報(bào)道，TERT（telomerase reverse transcriptase）啟動(dòng)子C228T和C250T突變與PTC的不良預(yù)后相關(guān)[13]。和他們的研究結(jié)果相一致，本研究也發(fā)現(xiàn)TERT啟動(dòng)子突變的患者臨床病理表現(xiàn)較差，這些患者往往年齡大、腫塊大、包膜侵犯和腺外侵犯比例高以及淋巴結(jié)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。而在Melo 等[14]作者的研究中發(fā)現(xiàn)沒有發(fā)現(xiàn)TERT啟動(dòng)子突變和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性，為什么Melo等作者的研究結(jié)果跟其他人的研究結(jié)果不一樣，具體原因目前還不清楚，一種可能是Melo等作者研究的TERT啟動(dòng)子突變的樣本量較小，尚不足以得出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有關(guān)。在本研究中，僅BRAF V600E突變組與PTC患者臨床病理特征無關(guān)（P值均＞0.05）；僅TERT突變組與患者年齡、腫瘤大小、腺外侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P值均＜0.05）；BRAF 和TERT 同時(shí)突變亦表現(xiàn)出與PTC 患者年齡、腫瘤大小、腺外侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P值均＜0.05），提示TERT 啟動(dòng)子突變與PTC患者預(yù)后相關(guān)，是否同時(shí)發(fā)生BRAF V600E突變對(duì)患者預(yù)后影響無明顯意義，提示兩個(gè)基因突變未產(chǎn)生協(xié)同作用，是否因樣本量不夠大的原因還有待進(jìn)一步證實(shí)。

本研究采用熒光PCR法檢測PTC患者BRAF V600E及TERT啟動(dòng)子突變情況，分析兩基因突變與患者臨床病理特征的關(guān)系，評(píng)估兩基因突變對(duì)患者預(yù)后的影響，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)BRAF V600E突變與患者預(yù)后無明顯關(guān)系，TERT啟動(dòng)子突變與患者預(yù)后明顯相關(guān)，這一結(jié)果提示BRAF V600E突變更可能是PTC發(fā)生的早期事件，對(duì)PTC的早期診斷有良好的應(yīng)用前景，TERT啟動(dòng)子突變可能是PTC發(fā)生的晚期事件，對(duì)PTC的預(yù)后判斷更有價(jià)值，而兩基因突變是否有協(xié)同作用有待進(jìn)一步研究。

表1 BRAF V600E或TERT啟動(dòng)子突變與PTC臨床病理特征的關(guān)系

特征 BRAFV600E χ2P TERT啟動(dòng)子 χ2P突變型(n=195) 野生型(n=53) 突變型(n=19) 野生型(n=229)性別 0.968 0.325 0.171 0.679男46 16 4 58女149 37 15 171年齡(歲) 1.538 0.215 5.635 0.018＜45 88 29 4 113≥45 107 24 15 116腫瘤大小(cm) 0.163 0.686 5.001 0.025＜1.0 108 31 6 133≥1.0 87 22 13 96雙側(cè)累及 0.997 0.318 0.476 0.490否114 35 10 139是81 18 9 90腺外侵犯 0.597 0.440 131.90 0.000否160 41 3 198是35 12 16 12淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 0.063 0.802 5.457 0.019否81 21 3 99是114 32 16 130

表2 僅BRAF或僅TERT或BRAF與TERT同時(shí)突變與PTC患者臨床病理特征的關(guān)系

注：P：僅BRAF突變型vs二者都沒突變型；P*：僅TERT突變型vs二者都沒突變型；P**：二者同時(shí)突變型vs二者都沒突變型

特征 二者都沒突變型(n=44) 僅BRAF突變型(n=185) P 僅TERT突變型(n=9) P* 二者同時(shí)突變型(n=10) P**性別 0.137 0.487 0.386男15 43 2 2女29 142 7 8年齡(歲) 0.100 0.006 0.003＜45 27 88 1 1≥45 17 97 8 9腫瘤大小(cm) 0.100 0.002 0.005＜1.0 30 106 1 2≥1.0 14 79 8 8雙側(cè)累及 0.699 0.585 0.444否25 111 6 7是19 74 3 3腺外侵犯 0.111 0.000 0.000否41 155 2 3是3 30 7 7淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 0.346 0.032 0.021否22 78 1 1是22 107 8 9

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