陳巧鳳，施建輝 ，聞 博

福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院骨科，福建 泉州 362000

骨折引起的急性血液供應中斷會導致骨組織中的氧張力（pO2）降低[1]，機體就會產(chǎn)生大量的氧自由基（ROS），對機體造成傷害。氧化應激會導致細胞功能紊亂甚至死亡，與機體衰老、腫瘤、代謝異常都有密切關系；骨折或肢體血運受阻后，成骨細胞會出現(xiàn)大量的ROS，其代謝、增殖受到明顯影響，骨基質(zhì)、成骨蛋白生長受到抑制，骨折修復減少[2-3]，骨折的延遲愈合和不愈合率明顯增高[4]。缺氧除了對骨折愈合產(chǎn)生影響，還減少成骨細胞生長，導致骨質(zhì)疏松[5]。

在缺氧對成骨細胞影響的大量實驗研究中，可以看出缺氧主要對成骨細胞增殖、分化及成骨特異性基因及蛋白的表達產(chǎn)生了負面影響[6-8]。研究提示持續(xù)12 h低氧會抑制了Runx2下游靶基因的表達，不利于成骨細胞的生長。此外，當氧濃度過低時（＜1%O2）也不利于成骨細胞的生成，成骨細胞在低氧條件下（1% O2）培養(yǎng)36 h后，成骨細胞增殖細胞核抗原（PCNA）的表達明顯下降[9]。已知缺氧時間的長短與機體破壞程度有密切關系，持續(xù)的缺氧可能造成機體不可逆轉(zhuǎn)的損傷。但，目前少有實驗對成骨細胞急性持續(xù)缺氧條件下增殖，凋亡的觀察研究。

韓桂秋等[10]發(fā)現(xiàn)缺氧嚴重影響成骨細胞的成長周期，但其僅檢測36 h這1個時間點，無從知道成骨細胞在缺氧的不同時間點的變化情況。有研究[11]描述成骨細胞在缺氧環(huán)境（1%O2）培養(yǎng)48 h，TNF-α明顯升高，但并沒有在持續(xù)缺氧環(huán)境下成骨細胞成長情況或凋亡情況的記錄。還有實驗將MC3T3-E1細胞置于37 ℃，厭氧瓶中與氧吸收包一起溫育，O2在0.5 h內(nèi)降低至小于0.1%[12]。但這樣處理可能會造成細胞生長氧環(huán)境的不穩(wěn)定，因此本實驗將成骨細胞置于厭氧培養(yǎng)箱的垣定環(huán)境培養(yǎng)，以期能比較客觀地觀察成骨細胞在急性持續(xù)缺氧條件下變化情況。本研究分別把hfob1.19放置于含1%O2厭氧培養(yǎng)箱及20%O2常氧箱內(nèi)培養(yǎng)24、48、72、96、120 h，研究在持續(xù)缺氧條件下的細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生以及細胞增殖、凋亡情況，并對比各個時間節(jié)點的變化，以便發(fā)現(xiàn)成骨細胞在急性缺氧條件下代謝變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 細胞來源

成骨細胞hfob1.19購于吉妮歐生物有限公司。

1.2 主要試劑及耗材

RPMI-1640：SH30809.01 B/500 mL（Hyclone，美國）；胎牛血清：SV30087.03/500 mL（Hyclone，美國）；雙抗：SV30010/100 mL（Hyclone，美國）；胰酶：SH30042.01/100 mL（Hyclone，美國）；PBS：SN331（南京生興生物技術有限公司，中國）；DMSO：C6295-50ML（Sigma，美國）；MTT：5 g（Bisharp，中國）；PIAnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒：EMS500FI/300T（eBioscience，中國）；活性氧檢測試劑盒（DCFHDA）：S0033（上海碧云天生物技術有限公司）。

1.3 主要儀器和設備

CO2細胞孵育箱（Thermo，美國）；厭氧培養(yǎng)箱（Thermo，美國）；美國多功能酶標儀（SpectraMax M5，MD，美國）；流式細胞儀：FACSCaliburBD （Biosciences，美國）；高速離心機（Thermo，美國）；熒光分光光度計（上海棱光，中國）。

1.4 細胞培養(yǎng)

（1）hfob1.19細胞是貼壁細胞，培養(yǎng)在1640培養(yǎng)基中，含15%胎牛血清，100 U/mL的青霉素，100 μg/mL的鏈霉素。培養(yǎng)在34 ℃，含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中。（2）當hfob1.19細胞長至80%～90%時，去除培養(yǎng)基，加入PBS洗1～2次，去除PBS后，加入1 mL胰酶消化1～3 min后，加入3 mL完全培養(yǎng)基中和胰酶終止消化，將消化的細胞轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，1000 r/min離心5 min。倒掉上清后，加入3 mL培養(yǎng)基重懸細胞，1:3傳代至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。（3）細胞的常氧與缺氧培養(yǎng)：將細胞用胰酶消化下之后，加入培養(yǎng)基重懸細胞，用血球計數(shù)板對細胞進行計數(shù)，六孔板每孔種2×106個細胞，將細胞搖晃均勻，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)過夜后，根據(jù)實驗分組分別放入34 ℃，含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。常氧條件：培養(yǎng)箱內(nèi)含20%O2，缺氧條件：培養(yǎng)箱內(nèi)含1%O2。

1.5 MTT檢測細胞增殖

1.5.1 實驗原理 活細胞的線粒體中存在NADPH相關的脫氫酶類，可將黃色的MTT還原為水不溶性的藍紫色甲臜，死亡的細胞該酶活性喪失，MTT不被還原。用DMSO溶解甲臜后用酶標儀檢測光密度值A570nm。

1.5.2 實驗步驟 （1）用血球計數(shù)板計5000個細胞分別加入96孔板中；（2）依據(jù)實驗分組條件分別常氧和缺氧條件下培養(yǎng)24、48、72、96、120 h后，去掉培養(yǎng)基，每孔加入50 μL MTT，在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h；（3）每孔加入150 μL DMSO，搖晃均勻，測定A570nm。實驗至少獨立重復3次。

1.6 流式檢測細胞凋亡

（1）在六孔板中分別種2×106個細胞，按照實驗分組分別常養(yǎng)、缺氧培養(yǎng)24、48、72、96、120，用胰酶消化收集細胞；（2）用預冷的PBS洗3次細胞，4 ℃，1000 r/min離心5 min，棄上清；（3）加入1 mL binding buffer洗細胞，4 ℃，1000 r/min離心5 min，棄上清；（4）加入100 μL binding buffer重懸細胞，加入5 μL PI和5 μL FITC-Annexin V，混合均勻，常溫避光孵育15 min，加入400 μL binding buffer混勻，立刻用流式細胞儀檢測。

1.7 檢測細胞內(nèi)ROS形成

1.7.1 裝載探針 細胞先分別常養(yǎng)，缺氧培養(yǎng)24、48、72、96、120 h，后裝載探針。按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L。細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細胞濃度為1 000 000～20 000 000/mL，37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。

1.7.2 檢測 使用488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長，在熒光分光光度計檢測熒光強度。

1.8 統(tǒng)計方法

采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，使用t檢驗應比較兩者差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MTT檢測細胞增殖

將成骨細胞分為常氧組與缺氧組進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)常氧培養(yǎng)條件下24、48、72、96、120 h的A值分別為0.65±0.04、0.78±0.04、0.92±0.03、0.97±0.02、0.97±0.09，常氧培養(yǎng)72 h之前細胞活性遂漸增加，增殖明顯，72 h之后細胞增長趨于平緩（圖1A）。而缺氧培養(yǎng)條件下24、48、72、96、120 h的A值分別為0.62±0.02、0.58±0.02、0.53±0.01、0.35±0.03、0.23±0.04，培養(yǎng)初期細胞活性有所降低，但降低趨勢較平緩，72 h之后細胞活性急劇下降（圖1B）。

圖1 常氧和缺氧培養(yǎng)條件下hfob1.19細胞的A值

2.2 流式檢測細胞凋亡

流式細胞儀檢測細胞凋亡發(fā)現(xiàn)在常氧培養(yǎng)條件下24、48、72、96、120 h的細胞凋亡率分別為（2.96±0.098）%、（3.363±0.055）%、（3.333±0.05）%、（3.263±0.047）%、（3.61±0.04）%，結果表明：常氧培養(yǎng)下，細胞凋亡少，各組間差別少。與常氧24 h組對比，各組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖2）。缺氧培養(yǎng)條件下24、48、72、96、120 h的細胞凋亡率分別為（3.417±0.065）%、（4.647±0.059）%、（5.57±0.06）%、（9.66±0.056）%、（14.87±0.35）%。在缺氧條件下成骨細胞隨著時間的延長，凋亡細胞增多，凋亡比例快速增加。與缺氧24 h組對比，各組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖3）。

圖2 流式細胞儀檢測常氧培養(yǎng)24～120 h hfob1.19細胞凋亡情況

圖3 流式細胞儀檢測缺氧培養(yǎng)24～120 h hfob1.19細胞凋亡情況

2.3 檢測細胞內(nèi)ROS形成

將成骨細胞分為常氧組與缺氧組進行培養(yǎng)，常氧培養(yǎng)條件下24、48、72、96、120 h的ROS值分別為2552±61.02、2577.33±34.02、2556±34.70、2604±18.33、2628.67±38.18，可見常氧條件下細胞內(nèi)活性氧水平較低，各個時間段活性氧水平差異不大，與常氧培養(yǎng)24 h組比較，各組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而缺氧培養(yǎng)條件下24、48、72、96、120 h的ROS值分別為 3074.67±126.70、3624±132.52、4395.33±215.53、4930±86.61、5741±167.14。缺氧條件下細胞內(nèi)活性氧水平高，隨著缺氧時間增長，活性氧水平快速升高。與常氧培養(yǎng)24 h組比較，各組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖4）。

圖4 常氧和缺氧條件下檢測hfob1.19細胞內(nèi)活性氧水平

3 討論

嚴重的血液供應中斷和血運重建不足顯著導致骨折愈合延遲或骨不連[13]，骨折部位在血流破壞后造成的缺氧環(huán)境可能導致成骨細胞死亡[14]，抑制骨折愈合。對于成骨細胞來說，它的生長是需氧性的，嚴重的低氧影響了成骨細胞的代謝。細胞內(nèi)的氧約有80%～90%在線粒體內(nèi)用于氧化磷酸化生成ATP，僅10%～20%在線粒體外用于生物合成、降解及生物轉(zhuǎn)化（解毒）作用等。嚴重缺氧首先影響線粒體外氧的作用，使神經(jīng)介質(zhì)的生成和生物轉(zhuǎn)化過程等降低，隨著缺氧的持續(xù)，影響線粒體的呼吸功能，ATP生成減少，產(chǎn)生大量ROS。當活性氧大量生成而超過抗氧化系統(tǒng)的清除能力，機體就會形成氧化應激狀態(tài)[15]，引起DNA氧化損傷和蛋白質(zhì)的表達異常，產(chǎn)生細胞毒效應并最終對機體造成不可逆損害。正常人體細胞內(nèi)也會產(chǎn)生一定的ROS，但機體內(nèi)存在著抗氧化還原系統(tǒng)，氧化及抗氧化處于一個動態(tài)平衡。當細胞持續(xù)處于缺氧狀態(tài)，ROS就不斷升高，Hou[16]將成骨細胞2%低氧環(huán)境下持續(xù)48 h培養(yǎng)，檢測細胞ROS持續(xù)升高，細胞內(nèi)乳酸不斷升高，考慮在缺氧條件下，大多數(shù)細胞改變代謝方式，糖酵解變?yōu)锳TP生成的主要途徑，糖酵解途徑產(chǎn)生大量乳酸，且糖酵解和ROS形成之間存在正反饋。但也有細胞在缺氧環(huán)境下產(chǎn)生ROS量的減少情況，比如人的 SV-HFO細胞是成骨細胞的前體，它在持續(xù)的2%O2培養(yǎng)的細胞中ROS產(chǎn)生減少，隨后保護性抗氧化酶SOD1和SOD2和CAT的基因表達降低。這表明在低氧張力下培養(yǎng)的細胞中ROS和H2O2自由基清除減少，這是成骨細胞從高保護狀態(tài)的能量切換到低保護狀態(tài)。在低氧條件下這種轉(zhuǎn)換降低ROS保護的缺點是，這使得細胞容易受到氧化應激和ROS的刺激，最終導致細胞凋亡增加，細胞增殖、礦化受影響[17]。SV-HFO細胞對低氧的反應仍然是負面的，雖然產(chǎn)生的ROS少，與hfob1.19反應不同可能與細胞性質(zhì)不同及氧濃度不同有關。本實驗結果提示常氧培養(yǎng)下的成骨細胞內(nèi)的存在一定量的ROS，但各組間ROS處于一個相對穩(wěn)定狀態(tài)。然而，當細胞處于長時間急性缺氧狀態(tài)，細胞內(nèi)ROS明顯升高，與同時間段常氧組相比，細胞內(nèi)ROS均升高，而且ROS的升高呈時間相關性，持續(xù)的缺氧造成成骨細胞內(nèi)ROS急劇升高。

據(jù)文獻[19]描述，大量ROS可造成細胞損傷，ROS損傷的機制包括直接損害細胞外基質(zhì)，促進其降解；損傷成骨細胞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA大分子；促進Ca2+從細胞內(nèi)Ca2+庫的釋放，擾亂成骨細胞內(nèi)Ca2+的內(nèi)穩(wěn)定，抑制成骨細胞分化；直接損傷成骨細胞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA等生物大分子，最終嚴重影響細胞的存活，導致細胞的凋亡等，ROS 致成骨細胞凋亡的機制可能是綜合性的。郭寶磊等[18]通過過氧化氫誘導MC3T3-E1細胞凋亡實驗中檢測線粒體膜電位下降，發(fā)現(xiàn)ROS導致線粒體Bax蛋白增加，線粒體通透性增加，激發(fā)線粒體凋亡途徑。在本實驗中，可見正常氧培養(yǎng)情況下，體外培養(yǎng)的成骨細胞凋亡率較低，而缺氧各組的成骨細胞凋亡率顯著增高，說明缺氧能夠加速成骨細胞的凋亡。成骨細胞的凋亡率與缺氧的時間長短相關，隨缺氧時間的逐漸延長，凋亡率逐漸升高，各組之間差異顯著，在缺氧72 h后，細胞凋亡率急劇上升。如果不予及時的糾正，有可能造成成骨細胞凋亡的不可逆變化。這些可能是由于培養(yǎng)環(huán)境的持續(xù)缺氧造成能量代謝的降低與細胞增殖所需代謝的增加造成能量代謝不平衡，產(chǎn)生大量ROS，ROS對細胞進破壞產(chǎn)生細胞凋亡增加造成。

缺氧同時還抑制了成骨細胞的增殖，并且這種抑制作用具有明顯的時間依賴性，隨著缺氧時間的延長，這種抑制作用越明顯。研究發(fā)現(xiàn)缺成骨細胞周期的調(diào)控，包括細胞在有絲分裂原作用下復制和細胞分裂的調(diào)控機制，抑制與細胞周期調(diào)節(jié)相關的基因會導致增殖的停止[19-20]。實驗同樣發(fā)現(xiàn)在成骨細胞缺氧72 h時出現(xiàn)細胞增殖能力拐點，增殖能力明顯下調(diào)。成骨細胞在急性缺氧時出現(xiàn)凋亡增加，增殖能力下降，并在72 h后出現(xiàn)拐點，考慮這種現(xiàn)象出現(xiàn)的主要原因是在急性缺氧早期，首先影響線粒體外氧的作用，使神經(jīng)介質(zhì)的生成和生物轉(zhuǎn)化過程等活動降低。所以細胞出現(xiàn)輕度的凋亡以及輕度的增殖能力下調(diào)，當缺氧持續(xù)作用時線粒體呼吸功能和F0F1-ATP酶活性受到抑制，電子傳遞受阻，發(fā)生氧化磷酸化解偶聯(lián)，線粒體ATP含量降低，從而出現(xiàn)細胞的大量凋亡及增殖能力急劇下降。與急性缺氧不同，當細胞出現(xiàn)慢性缺氧時，線粒體氧化磷酸化能力可以部分恢復，缺氧適應至少部分可以通過降低細胞基礎氧耗量，F(xiàn)0F1-A1P酶活性的損傷是部分可逆的，所以在慢性缺氧環(huán)境下，細胞有個慢性適應過程，不致于出現(xiàn)劇烈的變化[21]。成骨細胞對急性持續(xù)缺氧與間斷缺氧反應也不同，有實驗對成骨細胞進行分組，缺氧組在低氧培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h后常氧培養(yǎng)基中培養(yǎng)，低氧預適應組給予在10 min低氧培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)為10 min常氧培養(yǎng)基中培養(yǎng)3次，然后在4 h低氧培養(yǎng)基培養(yǎng)后轉(zhuǎn)為4 h常氧培養(yǎng)基中培養(yǎng)1次。發(fā)現(xiàn)測試細胞增殖能力常氧＞間斷缺氧＞持續(xù)缺氧[22]，間斷缺氧提高細胞缺氧的氧耐受，持續(xù)缺氧造成細胞增殖能力下降，影響細胞礦化功能。Wang[23]將人骨細胞置于用于產(chǎn)生厭氧條件的塑料袋中，發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下培養(yǎng)72 h的骨細胞降低其代謝活性，缺氧抑制骨細胞對血小板釋放的上清液的促有絲分裂反應以及與BMP-6孵育后成骨分化標志物堿性磷酸酶和骨鈣蛋白的表達。

研究發(fā)現(xiàn)，氧氣對成骨細胞增殖礦化的重要性，缺氧造成細胞凋亡，活性降低，成骨細胞的數(shù)量及活性對維持骨的代謝平衡非常重要，一旦這種平衡被破壞，就會引起骨代謝障礙。成骨細胞的數(shù)量取決于細胞凋亡與細胞增殖的平衡，這種平衡的喪失，也會導致各種代謝性骨病的發(fā)生。本實驗結果發(fā)現(xiàn)嚴重急性缺氧對成骨的生長產(chǎn)生不利的作用，而且在缺氧72 h 時會出現(xiàn)成骨細胞凋亡率急劇增加，增殖率急劇下降，可見缺氧時間對成骨細胞代謝也起了很重要的作用。因此，在骨科創(chuàng)傷及手術中要注意缺血缺氧時間的控制，及時的復氧，包括減少止血帶使用時間，控制出血，骨折及時復位及修復損傷血管等，減少組織缺氧時間，避免成骨細胞發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的凋亡。當然，缺氧后肢體缺氧后再復氧，可能產(chǎn)生再灌注損傷，加重細胞的氧化應應損傷[24]，抗氧化藥物的應用可能會減少應激反應帶來的損傷，這是實驗及臨床工作需要注意的地方。