王超　鄭繪霞

【摘要】 目的：通過研究微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）、程序性死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）及白介素6（interleukin 6，IL-6）在人結(jié)直腸腺癌組織中的表達(dá)，探討三者之間的相關(guān)性，分析其與結(jié)直腸腺癌臨床病理學(xué)參數(shù)間的關(guān)系。方法：用免疫組化法對312例結(jié)直腸腺癌組織及30例癌旁組織中錯(cuò)配修復(fù)基因（Mismatch repair genes，MMRs）、PD-L1及IL-6的表達(dá)進(jìn)行檢測，分析MSI、PD-L1、IL-6三者之間的相關(guān)性及各指標(biāo)與結(jié)直腸腺癌臨床病理學(xué)參數(shù)間關(guān)系。結(jié)果：結(jié)直腸腺癌組織中，MSI表達(dá)率為16.3%，微衛(wèi)星穩(wěn)定（Microsatellite stability，MSS）表達(dá)率為83.7%。PD-L1及IL-6在結(jié)直腸腺癌組織中的陽性表達(dá)率與癌旁組織相比均明顯上調(diào)（P<0.01）。結(jié)直腸腺癌組織中，MSI與PD-L1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（P<0.01），MSI與IL-6蛋白、PD-L1與IL-6蛋白表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)（P<0.01）。MSI表達(dá)與患者低齡（≤60歲）、升結(jié)腸、低分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而PD-L1、IL-6表達(dá)僅與腫瘤分化程度相關(guān)。結(jié)論：結(jié)直腸腺癌組織中PD-L1和IL-6的表達(dá)均明顯上調(diào)，均與結(jié)直腸腺癌的分化程度相關(guān)，可能作為結(jié)直腸腺癌惡性程度的評價(jià)指標(biāo)及臨床治療的靶點(diǎn)；PD-L1表達(dá)增高與MSI狀態(tài)及IL-6表達(dá)下調(diào)相關(guān)，通過檢測MSI及IL-6表達(dá)情況，可能預(yù)測抗PD-L1免疫治療的有效率，通過抑制腫瘤中IL-6的表達(dá)可能提高抗PD-L1治療的有效率；MSI更多表達(dá)于低年齡、升結(jié)腸、分化差及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，有利于免疫治療的初步分流。

【關(guān)鍵詞】 結(jié)直腸癌； PD-L1； IL-6； MSI

Expression and Significance of MSI，PD-L1 and IL-6 in Colorectal Adenocarcinoma/WANG Chao，ZHENG Huixia.//Medical Innovation of China，2018，15（26）：036-040

【Abstract】 Objective：To study the expression of microsatellite instability（MSI），programmed death ligand 1（PD-L1）and interleukin 6（IL-6） in human colorectal adenocarcinoma，to explore the correlation between them and the clinicopathological parameters of colorectal adenocarcinoma.Method：The expression of mismatch repair genes（MMRs），PD-L1 and IL-6 in 312 colorectal adenocarcinoma tissues and 30 adjacent tissues were detected by immunohistochemistry.Correlations of MSI，PD-L1 and IL-6，as well as the relationship between each index and clinicopathological parameters of colorectal adenocarcinoma was analyzed.Result：In colorectal adenocarcinoma，the MSI expression rate was 16.3%，and the microsatellite stability（MSS） expression rate was 83.7%.The positive rates of PD-L1 and IL-6 in colorectal adenocarcinoma were significantly higher than those in adjacent tissues（P<0.01）.In colorectal adenocarcinoma，MSI was positively correlated with PD-L1 protein expression（P<0.01）.MSI was negatively correlated with IL-6 protein expression， so was PD-L1 and IL-6 protein expression（P<0.01）.MSI expression was associated with younger age（≤60 years old），ascending colon，poorly differentiated，and no lymph node metastasis.The expression of PD-L1 and IL-6 was only related to the degree of tumor differentiation.Conclusion：The expression of PD-L1 and IL-6 in colorectal adenocarcinoma is significantly up-regulated，which is related to the differentiation of colorectal adenocarcinoma，and might be used as an index to evaluate the malignant degree of colorectal adenocarcinoma and as a target for clinical treatment.The increased expression of PD-L1 is associated with the down-regulation of MSI and IL-6 expression.By detecting the expression of MSI and IL-6，we could predict the effective rate of anti-PD-L1 immunotherapy，and increase the effective rate of anti-PD-L1 therapy by inhibiting the expression of IL-6 in tumor.The expression of MSI in patients with low age，ascending colon，poor differentiation and no lymph node metastasis is beneficial to the preliminary shunt of immunotherapy.

【Key words】 Colorectal cancer； PD-L1； IL-6； MSI

First-authors address：Basic Medical College of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.26.009

結(jié)直腸癌在我國具有較高的發(fā)病率及死亡率[1]，許多患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會(huì)，免疫治療與化療和放療相比不良反應(yīng)較輕[2]。微衛(wèi)星又稱簡單重復(fù)序列，當(dāng)錯(cuò)配修復(fù)基因（Mismatch repair genes，MMRs）缺失時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）。程序性細(xì)胞死亡受體1（PD-1）與其配體PD-L1結(jié)合引起免疫逃逸[3]，通過阻斷PD-1/PD-L1可用于治療腫瘤，研究表明MSI型結(jié)直腸癌對抗PD-L1免疫治療反應(yīng)良好[4-5]，但反應(yīng)率非常低。IL-6是一種多效細(xì)胞因子，在MSI陽性腫瘤中低表達(dá)[6]，研究發(fā)現(xiàn)阻斷IL-6可能提高抗PD-L1治療的有效率。本文擬通過免疫組化法檢測結(jié)直腸腺癌中MMRs、PD-L1及IL-6的表達(dá)，探討結(jié)直腸腺癌中MSI、PD-L1及IL-6之間的相關(guān)性及各指標(biāo)與結(jié)直腸腺癌臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系，以期為結(jié)直腸癌抗PD-L1免疫治療尋找一種新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院病理科2013年1月-2017年8月經(jīng)外科手術(shù)切除的結(jié)直腸腺癌石蠟標(biāo)本312例，30例癌旁組織作為對照。所有病例均為首發(fā)腫瘤，均有完整的臨床、病理資料，HE染色切片均經(jīng)高年資病理醫(yī)師鏡下明確診斷，術(shù)前未行放化療等輔助治療，癌旁組織距癌灶邊緣10 cm以上（鏡下未見癌細(xì)胞）。312例患者中，男174例，女138例；年齡37～86歲，平均（65.32±8.68）歲，>60歲213例，≤60歲99例；發(fā)生部位：降結(jié)腸、直腸123例，升結(jié)腸189例；分化程度（WHO大腸腺癌組織學(xué)分級）：高、中、低分化者分別為54、173、85例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者142例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者170例；臨床病理分期（AJCC TNM分期標(biāo)準(zhǔn)）：T1期+T2期171例，T3期+T4期141例。

1.2 方法

1.2.1 試劑 抗MLH1單克隆抗體、抗MSH2單克隆抗體、抗MSH6單克隆抗體、抗PMS2單克隆抗體、抗PD-L1單克隆抗體、抗IL-6單克隆抗體、免疫組化試劑盒和DAB試劑（中杉金橋試劑公司）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 按免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行。標(biāo)本常規(guī)10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片脫蠟水化，3%H2O2清除內(nèi)源性過氧化物酶活性，高壓熱修復(fù)，分別滴加鼠抗人MLH1單抗、兔抗人MSH2單抗、鼠抗人MSH6單抗、兔抗人PMS2單抗、鼠抗人PD-L1單抗、鼠抗人IL-6單抗，4 ℃過夜，復(fù)溫后滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，鏡檢。PBS代替一抗作空白對照。

1.2.3 結(jié)果判定 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均表達(dá)于胞核，癌旁正常組織為內(nèi)對照，癌組織中有一個(gè)細(xì)胞明顯著色即判為亞型陽性，至少一個(gè)亞型表達(dá)缺失判為MSI表達(dá)陽性，各亞型均表達(dá)判為MSS表達(dá)陽性。PD-L1表達(dá)于胞膜/胞質(zhì)，以50%著色判為表達(dá)陽性；IL-6表達(dá)于胞膜/胞質(zhì)，采用半定量積分判定：在40倍鏡下觀察著色強(qiáng)度：細(xì)胞未著色（0分）、淡黃色（1分）、棕黃色（2分）、棕褐色（3分）；在400倍鏡下判定陽性細(xì)胞百分比率：隨機(jī)觀察10個(gè)視野，陽性細(xì)胞百分比率為視野下陽性細(xì)胞數(shù)占所有瘤細(xì)胞的比值，取平均值，比值<5%（0分）、比值5%～25%（1分）、比值26%～50%（2分）、比值51%～75%（3分）、比值>75%（4分）[7]。將著色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分率的得分相乘，得積為染色指數(shù)（SI）。SI>4為陽性表達(dá)，≤4為陰性表達(dá)。判定過程由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)生負(fù)責(zé)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法進(jìn)行分析，兩兩指標(biāo)表達(dá)相關(guān)性用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMRs、PD-L1及IL-6在結(jié)直腸腺癌及癌旁組織中的表達(dá) 結(jié)直腸腺癌組織中MSI表達(dá)率為16.3%（51/312），MSS表達(dá)率為83.7%（261/312），癌旁組織中MSI表達(dá)率為0，MSS表達(dá)率為100%（30/30）。PD-L1及IL-6在結(jié)直腸腺癌組織中的陽性表達(dá)率分別為19.9%（62/312）、79.5%（248/312），PD-L1及IL-6在癌旁組織中的陽性表達(dá)率分別為3.3%（1/30）、23.3%（7/30），比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=14.19、69.81，P<0.01）。MSI型結(jié)直腸癌患者中，PD-L1、IL-6的陽性表達(dá)率分別為90.2%（46/51）、2.0%（1/51）；MSS型結(jié)直腸癌患者中，PD-L1、IL-6的陽性表達(dá)率分別為1.9%（5/261）、94.6%（247/261）。見圖1～3。

2.2 MSI、MSS、PD-L1及IL-6表達(dá)的相關(guān)性 312例結(jié)直腸腺癌組織中，MSI陽性表達(dá)51例，PD-L1陽性表達(dá)62例，MSI與PD-L1共同陽性例數(shù)為46例，共同陰性例數(shù)為245例，Spearman相關(guān)性分析顯示MSI與PD-L1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.78，P<0.01），見表1。IL-6陽性表達(dá)248例，MSI與IL-6共同陽性例數(shù)為1例，共同陰性例數(shù)為14例，Spearman相關(guān)性分析顯示MSI與IL-6蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.85，P<0.01），見表2。PD-L1與IL-6共同陽性例數(shù)為2例，共同陰性例數(shù)為4例，Spearman相關(guān)性分析顯示PD-L1與IL-6蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.93，P<0.01），見表3。

2.3 MSI、PD-L1與IL-6與結(jié)直腸腺癌臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系 （1）MSI在>60歲年齡組中的陽性表達(dá)率顯著低于≤60歲年齡組（字2=9.21，P=0.004）；MSI在升結(jié)腸的陽性表達(dá)率顯著高于降結(jié)腸、直腸（字2=9.08，P=0.004）；MSI在低分化組中陽性表達(dá)率明顯高于高、中分化組（字2=47.87，P<0.01）；MSI在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性表達(dá)率顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（字2=7.45，P=0.007）。MSI在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)與患者性別、腫瘤浸潤程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（2）PD-L1在低分化組中的陽性表達(dá)率明顯高于高、中分化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=71.92，P<0.01）。PD-L1在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)與患者年齡、性別、發(fā)生部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、腫瘤浸潤程度均無關(guān)（P>0.05）。（3）IL-6在低分化組中的陽性表達(dá)率低于高、中分化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=179.21，P<0.01）。IL-6在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)與患者年齡、性別、發(fā)生部位、淋巴結(jié)浸潤與否、腫瘤浸潤程度均無關(guān)（P>0.05）。見表4。

3 討論

近幾年，結(jié)直腸癌發(fā)病率遞增，預(yù)后較差[8]，傳統(tǒng)的手術(shù)、放化療等治療具有其局限性，免疫治療近年來備受推崇[9]。正常機(jī)體可將生長中的腫瘤進(jìn)行免疫系統(tǒng)清除，但腫瘤可發(fā)生免疫逃逸。PD-L1和PD-1近年來作為癌癥治療的潛在目標(biāo)受到密切的關(guān)注[10]，越來越多研究發(fā)現(xiàn)MSI型結(jié)直腸癌對抗PD-L1劑派姆單抗治療有效[11]。然而結(jié)直腸癌對PD-1或PD-L1阻斷的反應(yīng)率非常低[12]，且部分PD-L1陽性腫瘤患者對PD-L1/PD-1阻斷無效[13]。有研究發(fā)現(xiàn)IL-6水平可能影響結(jié)直腸癌對PD-L1治療的反應(yīng)[14]。本研究通過免疫組化法檢測結(jié)直腸腺癌組織及癌旁組織中MMRs、PD-L1及IL-6的表達(dá)，分析了PD-L1、IL-6、MSI三者之間的相關(guān)性及其與結(jié)直腸腺癌臨床病理學(xué)參數(shù)間關(guān)系，以期為結(jié)直腸癌的抗免疫治療水平的提高尋求一種較新思路或治療策略。

本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，結(jié)直腸腺癌組織中PD-L1、IL-6表達(dá)均明顯升高，與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致，提示PD-L1、IL-6的高表達(dá)可能與結(jié)直腸腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。MSI狀態(tài)下PD-L1表達(dá)增高且IL-6表達(dá)下降，提示三者之間可能存在某種關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步探索三者之間的相關(guān)性可能為提高臨床免疫治療找到一種新路徑。于是進(jìn)一步分析了MSI、PD-L1及IL-6三者之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸腺癌組織中，MSI與PD-L1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，MSI、PD-L1均與IL-6蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這提示三者之間關(guān)系密切，PD-L1表達(dá)上調(diào)與MSI狀態(tài)及IL-6的表達(dá)下調(diào)相關(guān)，通過檢測MSI及IL-6狀態(tài)可能更有利于篩選出適于抗PD-L1免疫治療患者，同時(shí)也能解釋臨床上出現(xiàn)的部分PD-L1陽性患者對PD-L1抗體耐藥的情況，這種情況下可能患者腫瘤細(xì)胞IL-6表達(dá)上調(diào)，影響PD-L1抗體效果。同時(shí)，通過抑制腫瘤患者IL-6的表達(dá)有可能提高PD-L1抗體治療的敏感性及有效率，將三者結(jié)合對于結(jié)直腸腺癌免疫治療可能有較好的應(yīng)用前景。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析了MSI、PD-L1及IL-6與患者結(jié)直腸腺癌臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)MSI表達(dá)與患者低齡（≤60歲）、升結(jié)腸、低分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與患者性別及腫瘤浸潤程度無關(guān)。PD-L1、IL-6表達(dá)僅與腫瘤分化程度相關(guān)，兩者的表達(dá)均與患者年齡、性別、發(fā)生部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、腫瘤浸潤程度無關(guān)。以上結(jié)果提示MSI有特定的某些臨床特征，有利于免疫治療的初步分流及腫瘤惡性程度的評估；另外PD-L1及IL-6在腫瘤中的表達(dá)上調(diào)可能參與了結(jié)直腸腺癌的發(fā)生發(fā)展，兩者與腫瘤分化程度相關(guān)，在一定程度上提示了腫瘤的惡性程度，可能作為結(jié)直腸腺癌的有效預(yù)后標(biāo)記物及臨床治療的靶點(diǎn)。

綜上所述，MSI及PD-L1、IL-6的表達(dá)上調(diào)均可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，三者之間具有一定聯(lián)系，目前此項(xiàng)研究尚少，需要更多研究數(shù)據(jù)及功能學(xué)的驗(yàn)證。將三者結(jié)合研究用于臨床可能有利于提高結(jié)直腸癌的免疫治療有效率，改善目前免疫治療受益人群低的情況。本研究為探索結(jié)直腸癌的免疫治療提供了一種新的可能，IL-6也有望作為一個(gè)新的靶點(diǎn)，用于結(jié)直腸腺癌的臨床治療。

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（收稿日期：2018-04-03） （本文編輯：張爽）