喬洪圖， 周 艷， 尹 娜， 陳林林， 劉 洋， 蘇 婷， 孫茂盛， 李鴻鈞

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所， 云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實驗室， 昆明 650118)

輪狀病毒(Rotavirus，RV)是導(dǎo)致5歲以下嬰幼兒嚴(yán)重腹瀉的重要病原體之一[1]。每年全世界大約有2億嬰幼兒感染輪狀病毒并發(fā)生腹瀉,大約50萬兒童死于該疾病[2-3]。輪狀病毒動物模型的建立有利于研究RV的感染機(jī)制及研發(fā)預(yù)防和治療RV感染的疫苗和特效藥物。國內(nèi)外曾報道與輪狀病毒相關(guān)的動物模型,包括無菌小豬、鼠、牛、羊、兔等，其中無菌小豬和乳鼠的研究較為成熟[4-5]。無菌小豬免疫系統(tǒng)與人類較為接近，且致病周期長，但是對實驗室條件要求較高，操作起來較為困難[6]。而乳鼠對輪狀病毒易感且繁殖能力強(qiáng)，易于試驗操作，因此我們選擇了Balb/c乳鼠來進(jìn)行輪狀病毒的建模。

本研究采用猴源輪狀病毒SA11,分別用不同劑量的毒株經(jīng)單次灌胃感染7 d齡的Balb/c乳鼠，建立猴源輪狀病毒SA11的Balb/c乳鼠動物模型，為后續(xù)疫苗的研發(fā)及疫苗保護(hù)性評價提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

MA104細(xì)胞、SA11毒株由本實驗室保存；輪狀病毒膠體金試劑盒(北京萬泰生物)；組織細(xì)胞原位凋亡檢測試劑盒(購自Vazyme公司)；FITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG(H+L)抗體(購自KPL公司)；SPF級Balb/c乳鼠(購自昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)。

1.2 方法

1.2.1 病毒培養(yǎng)

SA11株RV的增殖和滴度測定在MA104上進(jìn)行。當(dāng)細(xì)胞長成致密單層時接種RV。接種前，將原始病毒液從-80℃冰箱中取出，室溫溶解，向待接種的輪狀病毒液中加入終濃度為20 μg/mL的胰酶和600 μg/mL的氯化鈣,37℃水浴45 min。水浴完畢，將長成致密單層的MA104細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的含10%新生牛血清MEM生長液棄掉，加入無血清MEM維持液，反轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶清洗細(xì)胞，如此操作重復(fù)3遍，將清洗細(xì)胞的MEM維持液棄掉，加入已經(jīng)激活的輪狀病毒液，置于37℃,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中吸附90 min。向MEM維持液中加入終濃度為1 μg/mL的胰蛋白酶，并將其轉(zhuǎn)入吸附病毒的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，當(dāng)90%以上的細(xì)胞出現(xiàn)CPE時，即可收獲病毒。將收獲的病毒培養(yǎng)液反復(fù)凍融3次，使細(xì)胞破碎，釋放病毒，8000 r/min，4℃離心20 min，去除大的細(xì)胞碎片等成分，收集上清液，即病毒原液保存于-80℃冰箱備用。

1.2.2 乳鼠灌胃攻毒

灌胃攻毒之前，采集乳鼠糞便,離心取上清，輪狀病毒膠體金試劑盒及ELISA檢測糞便上清中是否存在RV抗原，尾靜脈采取Balb/c母鼠全血，ELISA檢測母鼠血清中是否存在抗輪狀病毒特異性抗體，排除所有輪狀病毒抗體陽性的動物。由于乳鼠過小，人工飼養(yǎng)困難，同一組乳鼠與哺乳母鼠同籠喂養(yǎng)。攻毒之前將7 d齡乳鼠與哺乳母鼠隔離，對乳鼠進(jìn)行饑餓1 h處理。分組情況如下：106PFU SA11/只、105PFU SA11/只、104PFU SA11/只、PBS，每組10只，利用8號灌胃針對乳鼠進(jìn)行單次灌胃感染。

1.2.3 攻毒后乳鼠腹瀉及精神狀態(tài)觀察

攻毒后0到7 d，將乳鼠與母鼠同籠喂養(yǎng)，每天觀察攻毒后乳鼠的精神狀態(tài)、腹瀉情況等。每隔24 h通過按壓乳鼠腹部采集乳鼠糞便，依據(jù)Boshuizen等對乳鼠腹瀉的評分規(guī)則，根據(jù)糞便的顏色、軟硬、數(shù)量等，對乳鼠的腹瀉進(jìn)行評分(0～4)，無糞便排出評分0分、棕色成形大便評分1 分、 棕色軟大便評分2 分、黃色軟大便評分3 分、黃色稀水樣便評分4 分、肛周糞便污染評分4 分，大于2分被認(rèn)為是有腹瀉[7]。并進(jìn)一步將糞便重懸于10%(M/V)冰冷的PBS中,8000 r/min離心取上清，分別使用輪狀病毒膠體金試劑盒及ELISA檢測糞便中的病毒抗原載量。將糞便上清在已加入PBS稀釋液的已包被山羊抗輪狀病毒多克隆抗體的ELISA板中進(jìn)行梯度稀釋，將待測糞便上清以每孔100 μL的量加入到ELISA板的第一列(每孔含有100 μL的PBS稀釋液)，形成1∶2的首稀釋度，然后將ELISA板第一列中2倍稀釋的糞便上清吸出100 μL加入到第二列孔中，形成1∶4的稀釋度，如此以2倍的稀釋度重復(fù)梯度稀釋10次，形成1∶2到1∶2048的稀釋度范圍，則待測糞便上清(100 μL)中的抗原量即等于其陽性孔的最高稀釋度，其數(shù)值再乘以10即可得出待測輪狀病毒抗原每毫升的抗原量(EU/mL)。

1.2.4 攻毒后乳鼠空腸的病理改變

乳鼠感染輪狀病毒24、48、72和96 h后每個試驗組各解剖乳鼠2只，取其空腸，將其固定于10%的福爾馬林溶液中，制作石蠟切片，經(jīng)HE染色觀察空腸的形態(tài)學(xué)改變。另取一份空腸固定于戊二醛中，用于電鏡觀察。

1.2.5 攻毒后乳鼠臟器的輪狀病毒抗原分布情況

乳鼠感染輪狀病毒24、48、72和96 h后每個試驗組各解剖乳鼠2只，取其心、肝、脾、肺、腎、小腸(空腸)、腦組織，存放于液氮中，用于制作冰凍切片，免疫熒光檢測各組織中輪狀病毒抗原的分布。冰凍切片用丙酮于4℃固定30 min，風(fēng)干后用3% BSA(PBS-BSA)于37℃放置1 h；然后將山羊抗輪狀病毒多克隆抗體(Goat anti-Rotavirus polyclonal antibody)按1∶1000稀釋，37℃孵育90 min；0.05%Tween(PBS-T)洗3次；將FITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG(H+L)抗體(Fluoresein Labeled Rabbit anti-Goat IgG(H+L)antibody)按1∶200稀釋，37℃孵育60 min；0.05%Tween(PBS-T)洗3次，顯微鏡觀察熒光。

1.2.6 攻毒后乳鼠空腸原位凋亡檢測

用原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(1684817,Roche),對感染RV 72 h后的實驗組和對照組乳鼠空腸石蠟切片作原位細(xì)胞凋亡檢測，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。輪狀病毒感染小腸絨毛細(xì)胞后，會引起細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞DNA發(fā)生斷裂。本試劑盒采用TUNEL法，應(yīng)用末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶在凋亡細(xì)胞斷裂DNA的3′-羥基(3′-OH)末端催化摻入熒光素-12-脫氧三磷酸尿苷(FITC-12-dUTP)，F(xiàn)ITC-12-dUTP標(biāo)記的DNA可以用熒光顯微鏡直接觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳鼠感染輪狀病毒后的臨床癥狀及排毒情況

乳鼠攻毒不同劑量的RV 24 h后，高、中劑量組乳鼠均出現(xiàn)明顯腹瀉，精神萎靡、毛色光澤暗淡、嗜睡、活動能力減弱等癥狀，攻毒72 h后乳鼠腹瀉最為嚴(yán)重，乳鼠肛門周圍有大量糞便污染，高劑量組部分乳鼠尾根部發(fā)生潰爛流血；攻毒96 h后乳鼠腹瀉減輕，乳鼠體征狀態(tài)開始好轉(zhuǎn)；感染120 h后乳鼠腹瀉已經(jīng)基本停止，乳鼠開始恢復(fù)到正常狀態(tài)。在整個實驗周期內(nèi)，對照組和低劑量組乳鼠無明顯腹瀉發(fā)生。乳鼠開始出現(xiàn)腹瀉的時間及腹瀉的嚴(yán)重程度與感染所使用毒種的劑量呈正相關(guān)，毒種的劑量越高，乳鼠出現(xiàn)腹瀉的時間越早，腹瀉持續(xù)的時間越長，腹瀉評分及腹瀉百分比越高(圖1)。乳鼠攻毒后的0到7 d，每天收集乳鼠的糞便，使用輪狀病毒膠體金試劑盒檢測乳鼠糞便的排毒情況。輪狀病毒膠體金檢測結(jié)果顯示(表1)，在攻毒24 h和72 h后，輪狀病毒陽性最強(qiáng)，72 h后檢測逐漸減弱，120 h至144 h膠體金檢測陰性。ELISA檢測攻毒24 h后各實驗組每只乳鼠的排毒情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高劑量攻毒組中乳鼠的最大排毒量可達(dá)1280 EU/mL,中劑量攻毒組中乳鼠的最大排毒量也可達(dá)到320 EU/mL(表2)。

表1 膠體金檢測乳鼠糞便中RV抗原結(jié)果

A：攻毒106PFU/只SA11 72 h 后乳鼠糞便膠體金檢測結(jié)果； B：攻毒105PFU/只SA-11 72 h 后乳鼠糞便膠體金檢測結(jié)果； C：攻毒104PFU/只SA11 72 h后膠體金檢測結(jié)果； D：灌胃PBS乳鼠糞便膠體金檢測結(jié)果。陽性結(jié)果以“+”號表示；陰性結(jié)果以“—”號表示。根據(jù)滴加糞便上清后，T檢測帶出現(xiàn)的時間長短，將RV抗原的陽性強(qiáng)度進(jìn)行劃分：++++≤2 min, 2 min<+++≤4 min, 4 min<++≤6 min, 6 min<+≤10；超過10 min T檢測帶出現(xiàn)或不出現(xiàn)都判為—

A：分別攻毒106PFU/只、105PFU/只和104PFU/只每組乳鼠腹瀉平均分的統(tǒng)計結(jié)果；B：分別攻毒106PFU/只、105PFU/只和104PFU/只每組乳鼠腹瀉百分?jǐn)?shù)的統(tǒng)計結(jié)果

圖1攻毒不同劑量每組乳鼠腹瀉平均分及腹瀉百分?jǐn)?shù)統(tǒng)計結(jié)果

Fig 1 The average score of diarrhea and the percentage of
diarrhea in each group neonatal mice with different dose

2.2 攻毒后乳鼠小腸的病理改變

乳鼠感染輪狀病毒72 h后，解剖乳鼠，采集小腸組織，制做石蠟切片，經(jīng)HE染色觀察小腸的形態(tài)學(xué)改變，輪狀病毒感染組的小腸絨毛可見明顯的腫脹及破損，小腸絨毛頂端可見大量的空泡化細(xì)胞，對照組未見異常(圖2)。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與PBS對照組相比較，輪狀病毒組的小腸絨毛排列紊亂，發(fā)生明顯皺縮以及細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴樣結(jié)構(gòu)(圖3)。

表2 ELISA檢測攻毒24 h后乳鼠糞便RV抗原結(jié)果

ELISA檢測攻毒24 h后乳鼠糞便RV抗原結(jié)果(單位:EU/mL)。A組：攻毒106PFU/只 糞便ELISA檢測結(jié)果； B組：攻毒105PFU/只 糞便ELISA檢測結(jié)果； C組：攻毒104PFU/只 糞便ELISA檢測結(jié)果； D組：PBS組糞便ELISA檢測結(jié)果。“—”表示未采到糞便

2.3 輪狀病毒抗原在各臟器中的分布情況

在感染輪狀病毒后，于不同時間點(diǎn)解剖乳鼠，采集相應(yīng)組織，制做冰凍切片，進(jìn)行免疫熒光檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在感染RV 24、48、72和96 h后，106PFU SA11組和105PFU SA11組乳鼠的小腸(空腸部位)以及腎臟組織內(nèi)均檢測到了輪狀病毒抗原抗原(圖4)，而104PFU SA11組和PBS對照組乳鼠的空腸和腎臟組織內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)輪狀病毒抗原。在不同劑量RV感染組中的心、肝、肺等其他組織內(nèi)未檢測到輪狀病毒抗原(資料未顯示)。

A：對照組; B：實驗組(攻毒105PFU/只SA11)。(a)：小腸絨毛頂端破損；(b)：絨毛空泡變性

圖2感染RV 72 h后實驗組和對照組乳鼠小腸病變情況(HE×200)

Fig 2 The small intestine lesions of the experimental
group and the control group (HE × 200)

A、B：對照組；C：攻毒106PFU/只SA11組；D：攻毒105PFU/只SA11組。實驗組與對照組相比小腸微絨毛發(fā)生明顯縮短，出現(xiàn)大量脂滴結(jié)構(gòu)。(a)(b)：小腸微絨毛排列整齊，結(jié)構(gòu)完整；(c)：小腸微柔毛脫落；(d)：小腸微柔毛皺縮變短、排列紊亂

圖3小腸電鏡圖片

Fig 3 Small intestine electron microscopy picture(TEM×20 000)

2.4 組織細(xì)胞原位凋亡檢測

通過對實驗組和對照組空腸組織原位凋亡檢測，發(fā)現(xiàn)攻毒RV 72 h 后，106PFU/只和105/PFU/只SA11實驗組小腸絨毛頂端細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡，凋亡細(xì)胞沿絨毛頂端成串排列，并可見凋亡細(xì)胞從絨毛上脫落。對照組和攻毒104PFU/只SA11組未檢測到明顯的凋亡細(xì)胞(圖5)。

A：對照組腎臟；B：攻毒106PFU/只SA11組腎臟；C：對照組小腸；D：攻毒106PFU/只SA11組小腸

圖4對照組和實驗組腎臟和小腸組織免疫熒光圖片(免疫熒光×200)

Fig 4 Immunofluorescence images of renal and small intestine tissues in the
control and experimental groups (Immunofluorescence×200)

A：對照組；B：攻毒104PFU/只SA11組小腸；C：攻毒106PFU/只SA11組小腸；D：攻毒105PFU/只組小腸

圖5小腸原位凋亡檢測(免疫熒光×200)

Fig 5 Detection of apoptosis in small intestine (Immunofluorescence×200)

3 討論與結(jié)論

輪狀病毒動物模型對于疫苗的研制與開發(fā)、抗病毒藥物的篩選、抗體體內(nèi)的治療、致病機(jī)理的研究等都具有重要的意義。目前輪狀病毒的動物模型主要分為兩種，一種是腹瀉模型，如無菌豬和乳鼠；一種是無腹瀉癥狀的感染模型，如大鼠、兔子、羊、牛等[8-9]。無菌豬和乳鼠是目前為止研究較為成功的輪狀病毒模型[10]。李晉濤等采用人源輪狀病毒W(wǎng)a株、G1和G3分別感染巴馬新生仔豬，引起仔豬發(fā)生明顯腹瀉及腸道病理改變，成功構(gòu)建了人源輪狀病毒的腹瀉模型[11]。無菌豬免疫系統(tǒng)與人類較為接近，且致病周期長，但是對實驗室條件要求較高，操作起來較為困難；而乳鼠對輪狀病毒易感且繁殖能力強(qiáng)，易于實驗操作，因此我們選擇了Balb/c乳鼠來進(jìn)行輪狀病毒的建模。

乳鼠在攻毒后會出現(xiàn)精神萎靡、活動力下降等臨床癥狀，且在24 h內(nèi)出現(xiàn)不同程度的腹瀉，72 h腹瀉最為嚴(yán)重，96 h逐漸減弱，120 h腹瀉完全消失。乳鼠開始出現(xiàn)腹瀉的時間及腹瀉的嚴(yán)重程度與感染所使用的毒種類別及毒種的劑量有關(guān)。當(dāng)使用同一毒種時，毒種的劑量越高，乳鼠出現(xiàn)腹瀉的時間越早，腹瀉持續(xù)的時間越長。本研究發(fā)現(xiàn)，SA11組中感染106PFU/只和105PFU/只可以使乳鼠發(fā)生明顯的腹瀉；輪狀病毒攻毒后，通過膠體金及ELISA的方式能夠檢測到實驗小鼠腸道有排毒，通過免疫熒光能夠檢測到小腸組織內(nèi)有輪狀病毒抗原，表明攻毒感染后輪狀病毒在實驗小鼠腸道組織內(nèi)得到了復(fù)制增殖；另一方面通過石蠟切片HE染色及電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，實驗乳鼠小腸的病理組織發(fā)生了明顯的改變，攻毒組的小腸絨毛排列紊亂，發(fā)生明顯皺縮以及小腸絨毛細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量的空泡化及脂滴樣結(jié)構(gòu)；輪狀病毒感染還能造成小腸部位凋亡細(xì)胞的增加。以上結(jié)果表明我們成功構(gòu)建了小鼠輪狀病毒感染的腹瀉模型。

有報道稱輪狀病毒在一定情況下也可導(dǎo)致腸道外臟器的感染。輪狀病毒感染乳鼠后可穿過腸道形成病毒血癥，感染腸道外的臟器[12-14]。通過免疫熒光，我們發(fā)現(xiàn)輪狀病毒感染乳鼠后，部分乳鼠腎臟的腎小球位置能檢測到輪狀病毒抗原。這說明輪狀病毒感染存在病毒血癥，但病毒血癥的發(fā)生與感染的病毒株、感染劑量及乳鼠自身的免疫狀態(tài)等有很大的關(guān)系。譚震在就診的120例輪狀病毒感染的患兒中發(fā)現(xiàn)只有7例發(fā)生了病毒血癥，而Kapion等在經(jīng)輪狀病毒感染的重度免疫缺陷嬰幼兒中發(fā)現(xiàn)均可發(fā)生病毒血癥[15-16]。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了猴源輪狀病毒SA-11株 Balb/c 乳鼠動物模型，為后續(xù)疫苗的研制與開發(fā)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。但由于乳鼠的致病周期短，無法長期觀察其病理過程，以及其與人的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)和體型過小等原因并不能完全用于評價疫苗的免疫效果。Monica等利用一種新分離的野生型猴源輪狀病毒TUCH灌胃攻毒14～42 d齡的嬰猴，攻毒后雖無腹瀉發(fā)生，但糞便中檢測到大量病毒抗原[17]。我們今后也將在恒河猴嬰猴身上展開一系列人源輪狀病毒ZTR-68及猴源輪狀病毒SA11的相關(guān)實驗，以期建立更為合適的輪狀病毒感染模型，為后續(xù)疫苗保護(hù)性評價提供更為完善的理論基礎(chǔ)。