宋春麗， 楊海泉， 馬道程， 許菲

(1. 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院， 無錫 214122; 2. 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院， 無錫 214122)

低聚果糖(Fructooligosaccharides)通常是由一個葡萄糖分子和幾個果糖單元組成的寡聚物[1]。在腸道中，低聚果糖可選擇性刺激腸道益生菌乳酸桿菌和雙歧桿菌的生長，具有調(diào)節(jié)腸道生態(tài)系統(tǒng)的作用。低聚果糖可改善高脂血癥中的血脂組成，降低血清中的膽固醇水平，且增加Ca2+和Mg2+等礦物質(zhì)的吸收[2]。除了調(diào)節(jié)腸道生態(tài)系統(tǒng)的益生元作用，低聚果糖還可通過直接或間接的ROS清除機制抵消氧化應(yīng)激，防止結(jié)腸癌等ROS相關(guān)疾病的發(fā)展[3-4]。因此，近幾年，低聚果糖被廣泛應(yīng)用于食品和制藥等工業(yè)領(lǐng)域[5]。

工業(yè)上生產(chǎn)低聚果糖主要以蔗糖為底物經(jīng)果糖基轉(zhuǎn)移酶催化反應(yīng)獲得，因此，提高果糖基轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)水平和催化效率有助于促進低聚果糖的發(fā)展。工業(yè)上以真菌，如日本曲霉(AsnergillusJaponicus,A.Japonicus)等來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶催化蔗糖來生產(chǎn)低聚果糖，但真菌在發(fā)酵過程中菌絲易彎曲成球給發(fā)酵帶來諸多不便。近年來，許多研究都圍繞提高果糖基轉(zhuǎn)移酶的催化效率進行，以期改善低聚果糖的生產(chǎn)產(chǎn)量。一些研究通過采用固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶催化蔗糖，使酶重復(fù)利用，提高果糖基轉(zhuǎn)移酶的催化效率[6]。野生型果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)菌株在產(chǎn)酶水平上均存在較大差異，初步篩選獲得的菌株產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)量相對較低，且其酶活力較低影響工業(yè)生產(chǎn)低聚果糖的水平。國內(nèi)外學(xué)者對果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)菌株進行了大量篩選工作[7]，并通過紫外誘變、紫外-氯化鋰復(fù)合誘變等手段篩選野生型菌株，以此提高野生型菌株產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶酶催化活力，取得了一定的研究進展[8]。相較于誘變技術(shù)，構(gòu)建果糖基轉(zhuǎn)移酶的重組生產(chǎn)菌株，實現(xiàn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的異源表達，是一種更加簡便高效的手段，在不同的宿主中異源表達果糖基轉(zhuǎn)移酶能夠大幅度提高果糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)量，且酶活力也有所提高，有利于擴大低聚果糖生產(chǎn)規(guī)模，提高產(chǎn)量[9-10]。

本研究采用基因工程技術(shù)，將黑曲霉(Aspergillusniger,A.niger)來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶的基因連接至pET28a表達載體，并導(dǎo)入E.coliBL21中，構(gòu)建一株E.coliBL21-pET28a-fru重組菌生產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶。重組菌株經(jīng)異源表達后，采用Ni2+柱純化獲得純的重組果糖基轉(zhuǎn)移酶，并測定其各方面的酶學(xué)性質(zhì)。本研究成功地將果糖基轉(zhuǎn)移酶在E.coli宿主進行異源表達，對于果糖基轉(zhuǎn)移酶的異源表達有重要意義，且促進低聚果糖的工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株及試劑

菌株E.coliJM109和BL21及pET28a質(zhì)粒為本實驗室保藏。A.nigerSG610(CICIM F0902)保藏于中國高校工業(yè)微生物資源和信息中心(CICIM-CU)。

快切酶購于賽默飛公司。DNA連接酶、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase購于Takara公司，IPTG購于上海生工。實驗中LB培養(yǎng)基用于種子培養(yǎng)，TB培養(yǎng)基用于發(fā)酵產(chǎn)酶。

1.2 構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-fru

反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)獲得果糖基轉(zhuǎn)移酶cDNA，以此為模板并設(shè)計帶有NcoⅠ和BamH Ⅰ酶切位點(下劃線)及組氨酸標(biāo)簽的引物，引物序列為：

上游5′-CATGCCATGGGCAAGCTTCAAACGGCTTC；

下游3′-CGGGATCCTTAGTGATGATGATGATGATGAGACTGACGATCCGGCC。

使用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase進行果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系與反應(yīng)條件見Takara公司說明書，經(jīng)PCR獲得A.niger菌株的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因fru。

使用快速內(nèi)切酶分別酶切PCR擴增的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因片段和pET28a質(zhì)粒，隨后將酶切片段經(jīng)連接酶連接，形成重組質(zhì)粒pET28a-fru。pET28a-fru導(dǎo)入感受態(tài)E.coliJM109細胞，將陽性轉(zhuǎn)化子進行雙酶切驗證。

1.3 重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的表達與純化

將驗證成功的陽性轉(zhuǎn)化子導(dǎo)入感受態(tài)E.coliBL21細胞，挑取陽性轉(zhuǎn)化子接種至TB液體培養(yǎng)基，37℃搖瓶培養(yǎng)，檢測菌液在600 nm下的吸光值達到0.8后，添加0.025 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達果糖基轉(zhuǎn)移酶。經(jīng)20 h后離心收集菌體，獲得胞內(nèi)果糖基轉(zhuǎn)移酶。

將離心收集的菌體經(jīng)磷酸緩沖液清洗2～3次后重新懸浮，使用超聲波破碎儀破碎細胞，使胞內(nèi)的果糖基轉(zhuǎn)移酶游離至胞外，離心收集上清，得到含果糖基轉(zhuǎn)移酶的溶液。使用0.22 μm的濾膜過濾除去上清液中雜質(zhì)，采用HisTrap HP 1 mL的Ni2+柱純化過濾后的酶液，收集單純的果糖基轉(zhuǎn)移酶。

1.4 蛋白濃度測定

蛋白濃度測定采用Takara公司的BCA蛋白濃度測定試劑盒，具體方法如下。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以牛血清白蛋白溶液為標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品，標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg/mL，加入BCA反應(yīng)液(試劑盒)，37℃放置20～30 min。用酶標(biāo)儀測定562 nm處吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

溶液中蛋白濃度測定：稀釋蛋白樣品，將其與BCA反應(yīng)液(試劑盒)，37℃放置20～30 min。用酶標(biāo)儀測定562 nm處吸光值，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣品中蛋白濃度。

1.5 果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活測定

果糖基轉(zhuǎn)移酶的一個酶活力單位(U)定義為：在特別條件下，每分鐘酶催化底物蔗糖分子生成1 μmol蔗果三糖所需酶量[11-12]。

酶活力測定方法為：50%(W/V)蔗糖溶液500 μL與pH 5.5的0.1 mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液250 μL混勻，于45℃預(yù)熱10 min，加入250 μL酶液反應(yīng)15 min，沸水浴15 min 終止反應(yīng)。取上清用0.22 μm膜過濾，高效液相色譜(HPLC)測定各組分的含量[9]。

1.6 果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶學(xué)性質(zhì)測定

1.6.1 動力學(xué)參數(shù)測定

以檸檬酸-Na2HPO4為緩沖液，蔗糖為底物，測定不同底物濃度(200～700 g/L)條件下，果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力的變化，并繪制雙倒數(shù)曲線，以此計算酶的Km和Vmax值。此外，葡萄糖是果糖基轉(zhuǎn)移酶的競爭性抑制劑[13]。由于果糖基轉(zhuǎn)移酶酶促反應(yīng)過程中生成葡萄糖，對酶促反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，因此，分析添加過量的葡萄糖(50 g/L和100 g/L)對重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的動力學(xué)參數(shù)的影響，并計算抑制常數(shù)Ki值。

1.6.2 最佳溫度反應(yīng)條件和熱穩(wěn)定性測定

在pH 5.5的檸檬酸-Na2HPO4條件下，以步驟1.5中的酶活力測定方法測定30℃～70℃溫度下重組酶酶活力，并計算相較于最高酶活力的相對酶活，確定重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的最佳反應(yīng)溫度。

將重組果糖基轉(zhuǎn)移酶在35℃、40℃、45℃溫度下各保溫0～60 min，每隔10 min取樣，按照步驟1.5中的酶活力測定方法測定重組酶殘留的酶活力，并計算相較于未保溫重組酶的相對酶活力，確定重組酶的熱穩(wěn)定性。

1.6.3 最佳pH反應(yīng)條件和pH穩(wěn)定性測定

在45℃溫度條件下，按照步驟1.5中的酶活力測定方法測定pH 3.0～10.0(緩沖液為檸檬酸-Na2HPO4和甘氨酸-NaOH，濃度為0.1 mol/L)條件下重組酶的酶活力。根據(jù)不同pH值條件下重組酶的酶活力變化情況，確定重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的最佳pH反應(yīng)條件。

將重組果糖基轉(zhuǎn)移酶在pH 3.0～10.0(緩沖液為檸檬酸-Na2HPO4和甘氨酸-NaOH，濃度為0.02 mol/L)條件下，25℃保溫24 h后，按照步驟1.5中的酶活力測定方法測定重組酶酶活力殘留。計算不同pH值條件下保存后殘留酶活相較于最高酶活力的相對酶活力，確定重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的pH值穩(wěn)定性。

1.6.4 金屬離子對酶活的影響

添加Li+、Ca2+、Mg2+、Ni2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Ag+和Co2+等不同的金屬離子濃度分別為1和5 mmol/L，測定添加金屬離子至酶促反應(yīng)體系后，酶活力的變化趨勢，分析添加金屬離子對重組果糖基轉(zhuǎn)移酶催化反應(yīng)的影響[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 表達重組果糖基轉(zhuǎn)移酶

圖1 構(gòu)建pET28a-fru

通過PCR擴增獲得A.niger果糖基轉(zhuǎn)移酶基因fru，果糖基轉(zhuǎn)移酶PCR模板為反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)獲得的cDNA(圖1)。將基因片段與載體pET28a分別用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和BamH Ⅰ進行酶切消化并連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-fru(圖1)。pET28a-fru質(zhì)粒導(dǎo)入E.coliJM109細胞，陽性轉(zhuǎn)化子送至天霖公司(無錫)進行測序。序列比對結(jié)果表明，果糖基轉(zhuǎn)移酶基因片段大小為1905 bp，編碼635個氨基酸。

將測序成功的陽性轉(zhuǎn)化子pET28a-fru轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliBL21細胞，篩選重組菌E.coliBL21-pET28a-fru陽性轉(zhuǎn)化子。將獲得的重組菌E.coliBL21-pET28a-fru接種至TB培養(yǎng)基中，IPTG誘導(dǎo)發(fā)酵生產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶，如圖2所示。在發(fā)酵過程中，重組菌E.coliBL21-pET28a-fru的菌體濃度逐漸增加，且隨著發(fā)酵的不斷進行，重組菌產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力逐漸提高，在發(fā)酵24 h后達到18.4 U/mg。

圖2 重組菌株E. coli BL21-pET28a-fru產(chǎn)酶曲線

經(jīng)Ni2+柱純化重組果糖基轉(zhuǎn)移酶，將純化前、后的果糖基轉(zhuǎn)移酶進行SDS-PAGE電泳分析，如圖3所示。與對照株相比較，表達重組酶菌株所在SDS-PAGE電泳泳道在66.4 ku附近有明顯條帶，與純化后的重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的目的條帶一致，表明果糖基轉(zhuǎn)移酶基因fru在E.coliBL21菌株中成功表達并純化。表達重組酶菌株的單位菌體胞內(nèi)蛋白濃度為480.3 mg/g，而對照株的單位菌體胞內(nèi)蛋白濃度為371.9 mg/g，進一步表明果糖基轉(zhuǎn)移酶基因fru在E.coliBL21菌株中獲得成功表達。測得重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的比酶活力為706.6 U/mg。王立梅[15]將A.japonicus來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因在釀酒酵母細胞中異源表達，酶活力平均為26.4 U/mg。

M：Marker；1：對照株(含pET28a空質(zhì)粒)胞內(nèi)蛋白；2：目的株胞內(nèi)蛋白；3：純化酶

圖3果糖基轉(zhuǎn)移酶SDS-PAGE電泳分析

Fig 3 SDS-PAGE analysis of fructosyltransferase

2.2 重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的動力學(xué)參數(shù)測定

研究中分析了酶促反應(yīng)體系中添加不同濃度的葡萄糖對酶促反應(yīng)的影響。當(dāng)添加50 g/L的葡萄糖時，重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的Km值由未添加時的1.8 mol/L變?yōu)?.9 mol/L(圖4-b)。Km值越大，酶與底物的親和能力越低，因此添加葡萄糖會抑制酶與底物蔗糖的結(jié)合。而當(dāng)添加的葡萄糖濃度由50 g/L變?yōu)?00 g/L時，重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的Km值變?yōu)?.8 mol/L，嚴(yán)重影響了酶與底物蔗糖的親和力。當(dāng)反應(yīng)體系中添加50 g/L的葡萄糖時，重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的Ki值為3.4 mol/L，當(dāng)反應(yīng)體系中添加100 g/L的葡萄糖時，重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的Ki值為0.3 mol/L。說明添加的葡萄糖濃度越高，對重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的抑制作用越強。

a：不添加葡萄糖；b：添加不同濃度的葡萄糖

圖4重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的雙倒數(shù)曲線

Fig 4 Lineweaver-Burk plots

2.3 果糖基轉(zhuǎn)移酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性測定

分析30℃～70℃溫度條件下重組果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力的變化。結(jié)果如圖5-a所示，重組酶在45℃條件下進行催化反應(yīng)時酶活力達到最高，而其他溫度條件下進行催化反應(yīng)的酶活力都會比45℃時的酶活力有所降低。當(dāng)催化反應(yīng)在40℃～50℃溫度條件下進行時的酶活力相對于最高酶活力大于80%以上。而當(dāng)催化反應(yīng)在60℃進行時，酶活力僅剩最適反應(yīng)溫度條件下酶活力的20%。文明等研究了來源于大蒜果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)該果糖基轉(zhuǎn)移酶具有熱不穩(wěn)定性，其最適反應(yīng)溫度為35℃，40℃以上溫度條件下時，酶活力下降明顯[17]。分析重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的熱穩(wěn)定性，結(jié)果如圖5-b所示。重組酶在35℃條件下保溫時，酶活力降低緩慢，酶的半衰期(t1/2)為25.2 min。在40℃時，重組酶酶活力損失加快，酶的t1/2為9.0 min。在45℃條件下，重組酶迅速失活，t1/2僅為1.6 min。

2.4 重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的最適反應(yīng)pH值及穩(wěn)定性

分析了pH 3.0～8.0及pH 8.0～10.0的不同pH條件對重組果糖基轉(zhuǎn)移酶酶反應(yīng)的影響。結(jié)果如圖6-a所示，在pH 5.5時重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活力達到最高，pH值升高或降低重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活力都有所降低。而pH值在5.0～6.5范圍內(nèi)時，重組果糖基轉(zhuǎn)移酶具有80%以上的酶活力。Han等研究洋蔥來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶化最適反應(yīng)條件為pH 5.0，溫度45℃[18]。

a：溫度對重組果糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性的影響；b：重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定性

圖5溫度對重組果糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性和穩(wěn)定性的影響

Fig 5 Effect of temperature on activity and stability
of recombinant fructosyltransferase

分析重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的pH值穩(wěn)定性，如圖6-b所示，重組酶在pH 3.5～8.0時相對于最高酶活力大于80%以上，且在pH 5.0～7.5時相對于最高酶活力大于90%以上，因此，重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的pH值穩(wěn)定性較好。

a：pH值對重組果糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性的影響；b：pH值對重組果糖基轉(zhuǎn)移酶穩(wěn)定性的影響

圖6 pH對重組果糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性和穩(wěn)定性的影響

Fig 6 Effect of pH on activity and stability of recombinant fructosyltransferase

2.5 金屬離子對重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的影響

金屬離子可以改變蛋白質(zhì)的總電荷而影響其性質(zhì)，也可以與酶的催化結(jié)構(gòu)域相互作用，從而減少或增加酶的催化活性[19]。研究中分析了終濃度為1.0 mmol/L和5.0 mmol/L的不同金屬離子對重組果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力的影響。結(jié)果如表1所示，1 mmol/L和5 mmol/L的Co2+、Mn2+、Zn2+對重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的催化反應(yīng)具有激活作用。1 mmol/L和5 mmol/L的Fe2+和Ag+對重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的催化反應(yīng)具有顯著抑制作用。1 mmol/L的Cu2+對重組果糖基轉(zhuǎn)移酶具有促進作用，但5 mmol/L的Cu2+對重組果糖基轉(zhuǎn)移酶具有抑制作用。Ghazi等研究了金屬離子對來源于A.aculeatus的果糖基轉(zhuǎn)移酶的影響，金屬離子Hg2+和Zn2+對重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的催化反應(yīng)具有抑制作用[20]。李慧娟等研究發(fā)現(xiàn)，Zn2+和Cu2+能夠抑制來源于萵苣的蔗糖:蔗糖-1-果糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性，且Ca2+能夠促進酶的催化反應(yīng)[21]。

表1不同金屬離子及濃度對果糖基轉(zhuǎn)移酶的影響

注：a±為標(biāo)準(zhǔn)偏差，N=3；bCK為對照

3 結(jié)論

本研究成功實現(xiàn)了A.niger來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因在E. coliBL21(DE3)中的異源表達，并測定純化后的重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的各項酶學(xué)性質(zhì)，包括其反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)，葡萄糖、溫度、pH值及金屬離子對重組酶酶活力的影響等。發(fā)現(xiàn)重組果糖基轉(zhuǎn)移酶在E.coli中進行異源表達時，生產(chǎn)周期明顯縮短，酶活力較高，且催化效率較好。異源表達的重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的最適反應(yīng)溫度和pH值條件適中，且在較寬的pH值范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。在重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶促反應(yīng)過程中，葡萄糖會抑制酶促反應(yīng)的進行，而且葡萄糖濃度越高抑制作用越顯著。Co2+、Mn2+及Zn2+對重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的催化反應(yīng)具有顯著激活作用。本實驗充分研究了重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶學(xué)性質(zhì)，對于利用果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)低聚果糖的工業(yè)化過程中具有重要的意義。