李奧, 尚夢婷， 木魁, 姜雙林

(1. 阜陽市第一中學(xué), 阜陽 236000; 2. 阜陽師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院, 阜陽 236037)

黑碳(Black carbon, BC)是由化石燃料和生物質(zhì)不完全燃燒產(chǎn)生的一種含碳的、高度芳香化的多孔高聚混合物，主要由元素碳(element carbon, EC)和少量的有機碳(organic carbon, OC)組成[1]。典型黑碳的形貌是球形小粒子，粒徑為0.01～1.0 μm。黑碳是大氣細(xì)顆粒物(PM2.5，又稱可入肺顆粒物)主要化學(xué)成分之一，我國黑碳顆粒的排放約占全球排放總量的四分之一[2]。研究表明，在構(gòu)成我國PM2.5的黑碳組分中，其中黑碳顆粒83%來自化石燃料和生物質(zhì)燃燒[3]。黑碳粒子具有發(fā)達的孔隙和比表面積大等特點，黑碳在氣-粒傳輸和非均相光化學(xué)反應(yīng)中，能吸附大氣中多種有毒有害物質(zhì)(如有機物和重金屬)，并能催化其化學(xué)反應(yīng)形成了二次黑碳粒子，誘發(fā)嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等疾病[3-4]。

研究表明，亞微米級(0.01～1.0 μm)的黑碳粒子很容易進入呼吸道并突破氣血屏障進入血液循環(huán)，能夠誘發(fā)機體產(chǎn)生一系列的炎癥反應(yīng)，其誘發(fā)炎癥的作用機理主要有免疫細(xì)胞損傷、DNA的損傷和氧化應(yīng)激等[3]。研究不同粒徑的黑碳顆粒懸浮液對小鼠肺泡巨噬細(xì)胞有明顯的毒性作用，并誘發(fā)小鼠產(chǎn)生急性炎癥反應(yīng)。不同劑量的黑碳顆粒物(粒徑0.1～1.0 μm)與大鼠肺泡巨噬細(xì)胞體外共培養(yǎng)的結(jié)果顯示，隨著黑碳濃度的增加，大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡率明顯上升。研究發(fā)現(xiàn)，黑碳暴露能誘發(fā)人上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)隨著暴露時間延長和黑碳劑量的增加，炎癥因子(IL-6、IL-8和TNF-α)基因表達量增強[5-6]。另外，郜鑫等研究了黑碳誘發(fā)小鼠的遺傳毒性，發(fā)現(xiàn)急性暴露于高劑量黑碳處理的小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，并出現(xiàn)了小鼠骨髓細(xì)胞遺傳損傷效應(yīng)[7]。

蠶豆體細(xì)胞具有6對大型染色體，采用蠶豆根尖微核實驗技術(shù)進行毒理學(xué)研究，具有操作簡便、檢測靈敏和快速等優(yōu)點，與動物毒理學(xué)實驗結(jié)果相比較具有較高的一致性[8-9]。目前，蠶豆根尖微核實驗是國際上常用的環(huán)境化學(xué)物質(zhì)毒性檢測技術(shù)，已經(jīng)被聯(lián)合國環(huán)境署(UNEP)、世界衛(wèi)生組織(WHO)、美國環(huán)境保護署(US-EPA)和我國環(huán)保部列為環(huán)境毒理測試的技術(shù)規(guī)程，在國內(nèi)外環(huán)境化學(xué)物質(zhì)毒性檢測中得到了普遍的運用[10-12]。因此，蠶豆根尖微核技術(shù)是環(huán)境毒理中常用的植物檢測體系，用來檢測環(huán)境中有毒有害物質(zhì)的遺傳毒性效應(yīng)[13-15]。本研究以蠶豆根尖為實驗材料，探討黑碳對蠶豆根尖細(xì)胞微核和有絲分裂的影響，以評價黑碳的細(xì)胞遺傳毒性，為黑碳顆粒物的環(huán)境毒理學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 材料

蠶豆(Viciafaba) 種子(品種為崇禮蠶豆)，購于阜陽市綠豐種子公司。黑碳1864(CAS：7440-44-0)，購自Aladdin公司，分子量12.01，比表面積為165.5 m2/g，pH 7.5，粒徑小于0.01 μm，黑碳顆粒呈球狀顆粒物。準(zhǔn)確稱取黑碳用蒸餾水溶解配制母液，然后用蒸餾水稀釋配制0、10、20、40、80、160和320 mg/L的濃度梯度供試。無水酒精、冰醋酸、堿性品紅、苯酚、甲醛和鹽酸等化學(xué)藥品均為分析純。

1.2 試劑

卡諾氏固定液(Carnoy′s Fluid)按照無水酒精與冰醋酸(3∶1)的比例配制；水解分離液按照鹽酸與95%酒精(1∶1)的比例配制。均保存4℃?zhèn)溆谩?/p>

改良苯酚品紅染液配制：將3.0 g堿性品紅溶解于100 mL 70%乙醇中，按照1∶9的比例將其與5%苯酚溶液混合，即得母液。將45 mL母液，6 mL 37%甲醛，6 mL冰醋酸混合均勻。保存4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗儀器

OLYMPUS光學(xué)生物顯微鏡、日光培養(yǎng)箱和發(fā)芽盒等。

1.4 方法與步驟

1.4.1 種子處理

選用籽粒飽滿大小一致的蠶豆種子浸泡于蒸餾水中，置于溫度25℃的培養(yǎng)箱中24 h，種子吸脹用濕紗布包裹放入墊有濕脫脂棉的發(fā)芽盒中，在25℃培養(yǎng)箱中催芽，當(dāng)蠶豆種子的初生根長至2 cm左右時，選取根尖發(fā)育良好的蠶豆，用于檢測黑碳的誘變效應(yīng)。

1.4.2 染毒與修復(fù)

用蒸餾水，將黑碳儲備液配置為0、10、20、40、80、160和320 mg/L，共 7個濃度梯度，在每個濃度中加根尖發(fā)育良好的5粒蠶豆種子，根尖完全浸入藥液中染毒48 h。染毒結(jié)束后，用蒸餾水沖洗3次(每次1 min左右)，待藥液沖洗干凈后再用蒸餾水對根尖修復(fù)培養(yǎng)24 h。

1.4.3 固定與解離

在10 mL試管中加5 mL卡諾氏固定液，剪取經(jīng)過藥液處理長約0.5 cm的根尖10條，25℃溫度下固定24 h，用95%酒精沖洗根尖，至不含冰醋酸為止。然后轉(zhuǎn)移至70%酒精中保存4℃?zhèn)溆谩?/p>

將已固定好的根尖轉(zhuǎn)移到10 mL的試管之中，加水解分離液2 mL，25℃溫度下處理15 min；倒出解離液后，再加固定液2 mL放置5 min左右使蠶豆根尖軟化。倒去固定液后，用蒸餾水反復(fù)沖洗蠶豆根尖呈白色微透明。

1.4.4染色與壓片

取蠶豆根尖放于潔凈的載玻片上用刀片縱橫切成數(shù)段，采用十字壓片法壓片，使根尖細(xì)胞充分分散。在載玻片一側(cè)滴1～2滴改良苯酚品紅染液，染色20～30 min，吸去多余的苯酚品紅染液。

1.4.5 鏡檢

每個處理濃度鏡檢3～5條蠶豆根尖，每條根尖鏡檢約1000個細(xì)胞，觀察統(tǒng)計根尖細(xì)胞有絲分裂的細(xì)胞數(shù)、分裂期的細(xì)胞數(shù)、染色體畸變的細(xì)胞數(shù)和微核數(shù)。參考段昌群等[9]的方法識別蠶豆根尖細(xì)胞微核，細(xì)胞有絲分裂指數(shù)參照儀慧蘭等[11]的方法計數(shù)。按照下述公式統(tǒng)計：

有絲分裂指數(shù)(%)= (分裂期細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%

微核率(%)=(微核細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×1000‰

多核仁率(%)=(多核仁細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞數(shù))×100%

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用DPS數(shù)據(jù)處理平臺(唐啟義和馮明光，2002)進行方差分析和顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑碳對蠶豆根尖細(xì)胞微核的影響

圖1顯示了黑碳對蠶豆根尖細(xì)胞微核的影響，結(jié)果表明在10、20和40 mg/L的低濃度下，根尖細(xì)胞微核率有所增加，但與對照(CK=0 mg/L)相比較無顯著性差異(P>0.05)，表明黑碳在低濃度下，黑碳不會明顯誘發(fā)根尖細(xì)胞的微核率。在黑碳濃度達到80、160和320 mg/L時，細(xì)胞微核率分別依次為13.8‰、29.7‰和38.9‰，與CK相比微核率產(chǎn)生了顯著差異(P<0.05)。黑碳的濃度與蠶豆根尖細(xì)胞微核率之間的相關(guān)回歸方程為y=1.542 9x2-6.278 6x+7.771 4相關(guān)系數(shù)R2=0.983 4，表明黑碳濃度與根尖細(xì)胞的微核率之間相關(guān)性強，顯示出明顯的劑量效應(yīng)。

*表示黑碳處理組和蒸餾水對照組差異顯著(P<0.05)；下同

圖1不同濃度黑碳對蠶豆根尖細(xì)胞微核的影響

Fig 1 Effects of various black carbon concentrations on
micronucleus ratio ofV.fabaroot tip cells

2.2 黑碳對蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂的影響

黑碳對蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂有明顯的影響，結(jié)果見表1。從根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)可以看出，蠶豆根尖經(jīng)過不同濃度的黑碳染毒處理后，根尖細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)與對照相比較均有不同程度的下降。在10～40 mg/L濃度時有絲分裂指數(shù)與對照沒有顯著性差異(P>0.05)；在80～320 mg/L濃度時有絲分裂指數(shù)與對照相比較有顯著的差異(P<0.05)。當(dāng)黑碳濃度為320 mg/L時，細(xì)胞有絲分裂指數(shù)僅為2.051 1%；中期、后期和末期細(xì)胞分裂指數(shù)均為0，表明中期、后期和末期細(xì)胞出現(xiàn)的頻率與對照相比較明顯減少。同時，根尖細(xì)胞壓片觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變形，細(xì)胞質(zhì)有解體的現(xiàn)象，而且對末期分裂指數(shù)的影響最顯著，在低濃度20 mg/L時，與對照之間的差異達到了顯著水平，有絲分裂指數(shù)為1.075 8%。

表1 黑碳對蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂的影響

2.3 黑碳誘發(fā)蠶豆根尖細(xì)胞的多核仁現(xiàn)象

從圖2中可知，不同濃度的黑碳處理后，誘發(fā)細(xì)胞核分裂出現(xiàn)異常，主要表現(xiàn)為多核仁現(xiàn)象。在10～40 mg/L濃度時核分裂異常率與對照沒有顯著性差異(P>0.05)；在80～320 mg/L濃度時，核分裂異常率與對照相比較有顯著的差異，尤其是20 mg/L濃度處理多核仁率為35.9%，與對照相比達到極顯著差異水平(P<0.01)。黑碳的濃度與細(xì)胞多核仁率之間的相關(guān)回歸方程為y=0.000 3x2+0.024 9x+1.402 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.978 3，表明黑碳處理誘發(fā)根尖細(xì)胞有絲分裂受到阻滯的同時，細(xì)胞核分裂異常也出現(xiàn)較明顯的劑量效應(yīng)。

圖2 不同濃度黑碳對蠶豆根尖細(xì)胞多核仁率的影響

3 討論

微核(micronucleus)是由外界有毒有害等化學(xué)因子誘導(dǎo)細(xì)胞染色體斷裂或丟失，在胞漿中形成 1 個或數(shù)個小核。微核的發(fā)生率與染色體的變異率有密切的關(guān)系，所以微核率是評價染色體損傷的主要指標(biāo)之一。蠶豆(Viciafaba)根尖細(xì)胞微核技術(shù)在環(huán)境污染物、農(nóng)藥和化學(xué)品等生物安全性檢測中得到了廣泛應(yīng)用[9,12,14-16]。前人的研究表明，環(huán)境污染物誘發(fā)的遺傳毒性產(chǎn)生于細(xì)胞分裂間期的DNA和染色體的復(fù)制合成過程中[10,14-15]。這種毒性效應(yīng)在細(xì)胞學(xué)標(biāo)志就是細(xì)胞分裂中形成微核，微核的產(chǎn)生和細(xì)胞的分裂異常密切相關(guān)，說明微核現(xiàn)象的發(fā)生頻率能夠反映化學(xué)毒性物質(zhì)誘發(fā)的細(xì)胞遺傳物質(zhì)的受損傷程度[15,17-19]。

本實驗結(jié)果表明，當(dāng)黑碳濃度上升到80 mg/L時，黑碳誘發(fā)的蠶豆根尖細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)的下降和微核率的增加與對照進行比較均達到了顯著差異；而伴隨著細(xì)胞有絲分裂指數(shù)的下降，微核率的增加出現(xiàn)了降低的趨勢，表明細(xì)胞有絲分裂水平與微核率兩者之間存在著相關(guān)性。黑碳誘發(fā)的蠶豆根尖細(xì)胞微核率的變化幅度明顯高于有絲分裂指數(shù)和多核仁率，提示黑碳誘發(fā)的蠶豆根尖細(xì)胞的微核要比有絲分裂敏感。同時，對根尖細(xì)胞的微核現(xiàn)象進行鏡檢時更加直觀可靠，所以在黑碳誘發(fā)的細(xì)胞毒性實驗中以微核率作為指標(biāo)具有明顯的優(yōu)勢。黑碳可誘發(fā)蠶豆根尖細(xì)胞的微核率升高，在低濃度(10～40 mg/L)下，微核率與對照相比沒有顯著差異；但在高劑量(80～320 mg/L)下，微核率的差異達到顯著水平，表明高濃度的黑碳對根尖細(xì)胞具有一定的遺傳誘變性。我們在黑碳對人肺細(xì)胞(A549)的毒理實驗中，觀察到高濃度黑碳對A549細(xì)胞的增殖有顯著的抑制效應(yīng)。郜鑫等研究了黑碳誘發(fā)小鼠骨髓細(xì)胞的遺傳損傷，但并沒有以微核率作為指標(biāo)[7]；不同學(xué)者用蠶豆根尖細(xì)胞檢測化學(xué)品的微核試驗結(jié)果出現(xiàn)的敏感性差異，可能與所用的化學(xué)材料和實驗方法有一定的關(guān)系[8,11,19]。另外，本實驗中觀察到的黑碳能誘發(fā)蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂中出現(xiàn)核異常等現(xiàn)象。綜合分析，黑碳在低濃度時的遺傳毒性較低，在高濃度時具有一定的遺傳毒性。