郭 楠 許 波

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是一種復(fù)雜的生殖內(nèi)分泌及代謝性疾病，育齡婦女的發(fā)病率約為10%，占無排卵性不育患者的30%～75%，以持續(xù)性月經(jīng)異常、雄激素分泌過多以及卵巢多囊性改變?yōu)樘卣?，主要臨床表現(xiàn)為月經(jīng)周期不規(guī)律、不孕、多毛和/或痤瘡，主要助孕措施包括生活方式調(diào)整、藥物干預(yù)、腔鏡手術(shù)以及輔助生殖技術(shù)[1-2]。PCOS合并不孕癥患者在行體外受精-胚胎移植周期時，其胚胎質(zhì)量、臨床妊娠率等多個指標均低于輸卵管性因素(輸卵管梗阻、粘連等)導(dǎo)致不孕的患者[3-5]。進一步研究[4-5]認為，PCOS患者卵母細胞質(zhì)量下降是造成PCOS患者臨床結(jié)局(包括優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率等)較差的主要原因之一。但目前尚缺乏關(guān)于卵母細胞質(zhì)量下降原因的研究。因此，本研究對PCOS患者的卵母細胞超微結(jié)構(gòu)進行分析以及檢測線粒體DNA(mitochondria DNA, mtDNA)拷貝數(shù)，探討PCOS患者卵母細胞質(zhì)量下降的影響因素，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取中國科學技術(shù)大學附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學中心2017年1～12月接受卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射技術(shù)(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)治療的115例不孕患者作為研究對象，年齡25～33歲，男方均為重度少弱精癥或梗阻性無精癥患者，男女雙方染色體檢查正常，均無糖尿病家族史。按女方是否伴PCOS分為試驗組(PCOS組，n=57)和對照組(非PCOS組，n=58)。試驗組均符合鹿特丹PCOS診斷標準[1-2]：①不排卵或偶發(fā)排卵；② 雄激素水平升高(>1.0 nmol/mL)，并排除其他因素(如先天性腎上腺皮質(zhì)增生、分泌雄激素腫瘤等)；③超聲顯示卵巢增大，單側(cè)直徑2～9 mm的卵泡≥12枚，或單側(cè)卵巢體積>10 mL。對照組:①平素月經(jīng)規(guī)律；② 超聲檢查無多囊卵巢改變；③ 基礎(chǔ)生殖內(nèi)分泌無異常，且無全身及其他婦科、內(nèi)分泌等疾病。

1.2 方法

1.2.1 卵母細胞獲取 所有研究對象采用標準長方案[3]控制性促排卵，即從前一月經(jīng)周期的黃體中期開始皮下注射促性腺激素釋放激素激動劑進行垂體降調(diào)節(jié)，14天后行卵泡刺激素、促黃體生成素、雌激素水平檢測和陰道超聲檢查，適時加用促性腺激素(國藥準字H20052130，麗珠集團麗珠制藥廠，藥品規(guī)格：以尿促卵泡素效價計75 IU)150～300 IU，當至少有2枚卵泡直徑≥18 mm或至少3枚卵泡直徑≥17 mm時，注射重組人絨毛膜促性腺激素(注冊證號：S20110045；生產(chǎn)單位：Merck Serono Europe Limited；藥品規(guī)格：250 μg)250 μg，36～38 h行超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵術(shù)。

收集廢棄卵母細胞(常規(guī)ICSI 42～48 h后未分裂的成熟受精卵母細胞)共187 枚，其中試驗組52枚用于超微結(jié)構(gòu)觀察，另38枚用于mtDNA拷貝數(shù)檢測；對照組57枚和40枚分別用于超微結(jié)構(gòu)觀察和mtDNA拷貝數(shù)檢測。

1.2.2 卵母細胞超微結(jié)構(gòu)觀察 將卵母細胞樣本置戊二醛(25 g/L)4℃固定6 h，1×硝酸緩沖鹽溶液洗滌；常溫下1%鋨酸固定1.5 h，之后乙醇梯度脫水。樣本完成脫水后，環(huán)氧丙烷透明30 min，置環(huán)氧丙烷與環(huán)氧樹脂(1∶1)混合液中浸透至少1.5 h，環(huán)氧樹脂包埋，65℃烤箱中固化4 h。以60～80 nm厚度對包埋組織進行切片，后醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色，制備好的電鏡樣品JEM- 1230 型透射電鏡下觀察。

1.2.3 卵母細胞線粒體數(shù)量統(tǒng)計與mtDNA拷貝數(shù)檢測 卵母細胞電鏡切片中，具有圓滑的橢圓形或者紡錘形，線粒體內(nèi)的橫嵴清晰，結(jié)構(gòu)完整的線粒體標記為正常線粒體并計數(shù)；而整體輪廓不清晰，內(nèi)含空泡，缺少明確的嵴結(jié)構(gòu)標記為異常線粒體并計數(shù)。同時，對每張切片的卵母細胞面積進行計算。每個卵母細胞至少統(tǒng)計隨機選取的3張電鏡切片，之后統(tǒng)計每個卵母細胞單位面積內(nèi)的線粒體數(shù)量，計算正常/異常線粒體比例。

卵母細胞經(jīng)NaH2PO4(pH 2.0)去除透明帶后入液氮保存。采用熒光實時定量PCR法檢測卵母細胞mtDNA拷貝數(shù)，SYBR premix ExTaqTMII試劑盒購自日本TaKaRa公司。反應(yīng)體系：5 μL SYBR+0.4 μL引物+3μL模板，補水至10 μL。聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)反應(yīng)條件：95℃變性10 s，95℃變性5 s后61℃退火31 s，共40個循環(huán)。PCR操作在ABI 7500 實時熒光定量PCR擴增儀(Applied Biosysterms公司)完成，內(nèi)標曲線由10倍稀釋液生成，標準品為1 ng PCR產(chǎn)物中含有158 bp的5.8×109雙鏈DNA分子，每次反應(yīng)的標準曲線通過標準品確定，每個樣品的起始 mtDNA 拷貝數(shù)通過此標準曲線來確定。卵母細胞mtDNA拷貝數(shù)分析的引物序列為,ND1-F :5’-GGCTACATACAATTACGCAAAG-3’,R :5’-TAGAATGGAGTAGACCGAAAGG -3’。

1.3 觀察指標 入院后收集患者的一般資料，包括年齡、體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)。并于月經(jīng)第2～3天清晨空腹采血檢測生化指標。卵母細胞電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察細胞結(jié)構(gòu)和數(shù)量及mtDNA拷貝數(shù)的熒光實時定量PCR檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者臨床資料比較 兩組患者年齡、基礎(chǔ)雌激素、基礎(chǔ)卵泡刺激素、基礎(chǔ)催乳素水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，試驗組體質(zhì)指數(shù)、基礎(chǔ)雄激素、基礎(chǔ)促黃體生成素、血糖及胰島素水平均高于對照組(P<0.05)。詳見表1。

2.2 兩組卵母細胞的超微結(jié)構(gòu)比較 兩組卵母細胞的透明帶結(jié)構(gòu)基本一致，均為網(wǎng)狀的疏松結(jié)構(gòu)，含有顆粒細胞碎片殘留和少量纖維物。透明帶與卵母細胞膜間存在卵周隙，卵周隙均可見樹突狀的微絨毛，胞膜近卵周隙的位置可見大量皮質(zhì)顆粒，詳見圖1。兩組高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細胞的形態(tài)和分布均未見異常。

表1 兩組患者一般臨床資料比較

對照組卵母細胞線粒體分布均勻，功能和形態(tài)正常的線粒體呈現(xiàn)較為圓滑的橢圓形或紡錘形，線粒體內(nèi)的弧形或橫嵴較為清晰，結(jié)構(gòu)完整。試驗組大量的線粒體結(jié)構(gòu)不清晰，缺少明確的嵴結(jié)構(gòu)，且整體輪廓不清楚，內(nèi)含空泡。試驗組中異常線粒體比例58.7%高于對照組17.7%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.260,P=0.037)，詳見圖2。同時，試驗組卵母細胞內(nèi)線粒體數(shù)量(44.3±9.6)個/切片低于對照組(65.4±12.7)個/切片，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.670，P=0.042)，詳見圖3。

圖1 卵母細胞透明帶和細胞膜周邊超微結(jié)構(gòu)

注：ZP為透明帶，PVS為卵周隙；黑色箭頭為皮質(zhì)顆粒，白色箭頭為微絨毛；標尺為500 nm

圖2 卵母細胞內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)比較

注：黑色箭頭為正常線粒體；白色箭頭為異常線粒體

圖3 卵母細胞內(nèi)線粒體數(shù)量比較

注：圓圈內(nèi)表示單位面積內(nèi)線粒體數(shù)量

2.3 卵母細胞內(nèi)mtDNA拷貝數(shù)檢測 利用熒光實時定量PCR檢測兩組卵母細胞內(nèi)mtDNA拷貝數(shù)。結(jié)果，試驗組卵母細胞內(nèi)mtDNA拷貝數(shù)(54 390±19 139)個低于對照組(88 135±44 235)個，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.321，P=0.027)。

3 討論

PCOS是育齡婦女最常見的生殖內(nèi)分泌疾病。PCOS患者的內(nèi)分泌環(huán)境復(fù)雜，特征表現(xiàn)為卵泡期基礎(chǔ)黃體生成素水平升高，并常伴有高雄激素血癥、高胰島素血癥以及肥胖等多種內(nèi)分泌及代謝異常[2]。本次研究提示,PCOS組患者體質(zhì)指數(shù)、基礎(chǔ)雄激素、黃體生成素、血糖、胰島素水平較正常對照組均有顯著升高，與上述研究結(jié)果一致。同時有研究[3-5]證實，PCOS患者的ART臨床結(jié)局較差，表現(xiàn)為受精率和種植率下降，其主要原因與卵母細胞質(zhì)量下降和胚胎發(fā)育潛能降低有關(guān)[5,7]，并發(fā)現(xiàn)PCOS患者卵泡液內(nèi)的一些對卵母細胞質(zhì)量及發(fā)育潛能起負面影響的細胞因子如腫瘤壞死因子-α、粒細胞集落刺激因子等出現(xiàn)異常表達[8-9]。盡管這些研究都認為PCOS患者卵母細胞質(zhì)量會下調(diào)，但是其結(jié)論主要來源于臨床結(jié)局的推論或生化指標變化的推測，而病理機制尚不完全清楚。

線粒體是卵母細胞中數(shù)量最多，也是最重要的細胞器，參與卵母細胞的基本生理活動如生發(fā)泡破裂、紡錘體形成、染色體分離等[6,11]。線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變將直接影響卵母細胞的代謝、增殖和分化[11-12]。有研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，成熟卵母細胞內(nèi)的線粒體明顯多于未成熟卵母細胞，且卵母細胞發(fā)育能力與線粒體數(shù)量呈正相關(guān)；高齡女性的卵母細胞中mtDNA拷貝數(shù)明顯低于年輕女性，且隨年齡增長，線粒體內(nèi)mtDNA的突變率明顯增高，線粒體膜電位與ATP水平逐漸降低。直接觀察卵母細胞內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)是評估卵母細胞質(zhì)量最直接和客觀的方法[10]。本研究聯(lián)合透射電鏡和熒光實時定量PCR技術(shù)對PCOS患者卵母細胞內(nèi)關(guān)鍵細胞器線粒體的結(jié)構(gòu)和數(shù)量進行分析，結(jié)果顯示PCOS患者卵母細胞內(nèi)線粒體數(shù)量明顯下降，且出現(xiàn)明顯的形態(tài)學異常如缺少嵴結(jié)構(gòu)，內(nèi)含空泡，輪廓不清等，上述改變可能會導(dǎo)致卵母細胞能量代謝和氧化應(yīng)激異常，最終影響卵母細胞和胚胎的質(zhì)量。

綜上所述，PCOS患者卵母細胞內(nèi)異常線粒體比例升高和mtDNA拷貝數(shù)下降，可能會導(dǎo)致PCOS患者的卵母細胞中線粒體參與的能量代謝、氧化應(yīng)激等關(guān)鍵過程受損，并最終反映為卵母細胞和胚胎質(zhì)量的降低。