常 琦 劉 濤 張 磊 高 琪

術(shù)后腸粘連是腹腔手術(shù)后最為常見的并發(fā)癥，發(fā)生率約93%[1]。腸粘連最常見的并發(fā)癥是腸梗阻，其次會引起育齡婦女不育。目前預(yù)防術(shù)后腸粘連形成的藥物或材料較多，如各種形式的膜類材料、粘性膠和腹膜內(nèi)溶液類及中藥制劑等。但是能有效地預(yù)防術(shù)后腸粘連形成的材料仍然缺乏[2]。研究[3]顯示,芍藥苷可通過降低炎癥反應(yīng)而減輕關(guān)節(jié)炎，故本研究通過構(gòu)建腸粘連模型，評估粘連形成結(jié)局，檢測術(shù)后的轉(zhuǎn)化因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、白介素-8(interleukin 8，IL-8)的表達量，明確芍藥苷是否可通過降低炎癥反應(yīng)減輕術(shù)后粘連形成，為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 選取健康雄性大鼠40只，3周齡，體質(zhì)量為(130.00±10.00)g(購于延安大學(xué)實驗動物中心)；TGF-β、IL-8 ELISA試劑盒購自武漢建成生物科技公司；TGF-β、IL-8抗體購自Sigma公司購買；明質(zhì)酸鈉鹽購自上海華源生命科學(xué)研究開發(fā)有限公司；芍藥苷購自上海麥克林生物科技公司；其余實驗器材均共享自延安大學(xué)基礎(chǔ)實驗室。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 采用電腦編號隨機抽取大鼠，分為空白對照(Sham)組、對照組(Control)組、透明質(zhì)酸鈉鹽(Hyaluronate)陽性對照組(HA組)以及芍藥苷組(Paeoniflorin)4個組；每組大鼠為10只。

1.2.2 造模及給藥 術(shù)前3天將4組動物放入飼養(yǎng)室中，使動物習(xí)慣飼養(yǎng)環(huán)境，手術(shù)前晚禁食不禁水；采用戊巴比妥麻醉，麻醉劑量為40 mg/kg，麻醉后所有動物剃毛消毒，無菌下進行手術(shù)。Sham組正常開腹后找到盲腸向外拉出然后放回；其余3組均參照李培寧教授[4]的盲腸摩擦+對應(yīng)腹壁損傷模型進行腸粘連造模，即進行盲腸無菌濕紗布摩擦，均勻摩擦致漿膜破損出現(xiàn)微小出血點；對應(yīng)腹壁使用手術(shù)刀片刮損直至壁層腹膜破損。HA組完成造模后于摩擦面給予HA 10 mg(濃度為10 mg/mL)。造模完成后逐層關(guān)閉腹腔。芍藥苷組造模完成后麻醉清醒即通過灌胃給予60 mg/(kg·d)芍藥苷。芍藥苷的給藥劑量與方式, 參照文獻[5-6]并結(jié)合芍藥苷毒理學(xué)劑量。

1.3 觀察指標(biāo) 構(gòu)建大鼠模型后第10天二次剖腹，按照Evans[5]的標(biāo)準(zhǔn)對各組粘連進行分級后并評分；通過病理分析各組炎癥滲出情況；比較各組GF-β、IL-8的表達水平。

1.3.1 粘連評分及標(biāo)本采集 術(shù)后第10天，采取U型開腹，觀察粘連形成情況。由2位非直接參與實驗人員參照文獻[5]對粘連進行分級后并評分。0分:無粘連;1分:1 ～ 2處輕微粘連, 輕拉即開;2 分:2處以上粘連, 尚能分離,分離后不留痕跡;3分:多處粘連, 較難分離或粘連雖不多, 但不能分離;4 分:粘連成團, 不能分離。評分完畢后進行粘連標(biāo)本采集，將標(biāo)本直接放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫蝗「怪鲃用}血用于檢測細胞因子。

1.3.2 病理學(xué)分析炎癥滲出 常規(guī)石蠟切片HE染色,光鏡觀察粘連組織中炎癥細胞等病理參數(shù)的變化情況；每只大鼠粘連組織切5張切片，隨機選取2張切片，其中每張切片隨機選取3個高倍視野(20×10)進行評分，參照Saber法[6]對每只大鼠切片進行評分。炎癥評分：1分，無炎癥反應(yīng)細胞；2分，鏡下可見巨核細胞、淋巴細胞和漿細胞；3分，鏡下可見巨核細胞、漿細胞、嗜酸性細胞和中性粒細胞；4分，鏡下可見炎癥細胞浸潤和微小膿腫形成。纖維形成評分：0分，無纖維形成；1分，輕度纖維形成；2分，中度纖維形成；3分嚴(yán)重纖維形成。

1.3.3. TGF-β、IL-8的表達 采用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)定量分析TGF-β、IL-8的表達。取粘連組織40 mg充分研磨，RIPA裂解后常規(guī)使用BCA法蛋白定量。根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線統(tǒng)一上樣量為40 μg，其他凝膠配置及溶液配置均參照試劑盒說明書。設(shè)置電壓濃縮膠：75 V 30 min；分離膠恒壓110 V 1.5 h；一抗TGF-β濃度為1∶800、IL-8濃度為1∶500；最后進行Image Lab(美國)發(fā)光、圖像采集及數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠術(shù)后腸粘連的分級及評分比較 術(shù)后第10天，肉眼觀察Control組大鼠有大量的腸粘連出現(xiàn)，創(chuàng)面與小腸、腹壁間粘連廣泛，粘連組織致密，難以分開；Sham組中傷口周圍有部分腸粘連，無其他粘連；HA與Paeoniflorin(芍藥苷)組腸粘連顯著減少，而Paeoniflorin組腸粘連較HA組較少(見圖1)。Control組大鼠粘連等級都在3～4級，平均評分為(3.43±0.35)分；Sham組粘連等級在1～2級，平均評分為(1.33±0.41)分；HA組中粘連等級在2～3之間，評分為(2.13±0.61)分；芍藥苷組中粘連等級為1～2級，平均評分為(1.81±0.44)分,與Control組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖2。

圖1 術(shù)后各組大鼠腸粘連情況對比

圖2 術(shù)后各組粘連的評分

注：A為術(shù)后粘連等級圖；B為術(shù)后粘連評分圖；*本組與Control組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

2.2 4組大鼠炎癥滲出比較 通過病理分析各組大鼠炎癥滲出，結(jié)果顯示Control組粘連組織中有大量的炎癥細胞滲出，有新生的毛細血管產(chǎn)生；在Sham組中無炎癥細胞滲出；在HA組中炎癥細胞中等滲出；Paeoniflorin組中炎癥較Control組顯著降低，并且優(yōu)于HA組，詳見圖3、4。

2.3 TGF-β、IL-8的表達水平及定量分析 采用ELISA檢測TGF-β、IL-8的表達，結(jié)果顯示Paeoniflorin組中TGF-β、IL-8的表達水平明顯降低，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),詳見圖5。采用Western blot定量分析TGF-β、IL-8水平，結(jié)果顯示在Paeoniflorin組中TGF-β、IL-8的表達水平降低，與血中TGF-β、IL-8的表達結(jié)果一致，詳見圖6。

圖3 術(shù)后各組炎癥病理(HE×200)

圖4 術(shù)后各組HE染色炎癥評分

注： *表示與對照比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

圖5 ELISA分析術(shù)后炎癥因子TGF-β與IL-8

注：A為術(shù)后各組GTF-β含量的變化；B為術(shù)后各組IL-8含量變化。*與對照比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

圖6 Western blotting定量分析炎癥因子TGF-β與IL-8

3 討論

腹膜間皮細胞受損后其修復(fù)是一個復(fù)雜的過程。當(dāng)敏感的間皮細胞受到打擊或局部手術(shù)創(chuàng)傷后則有一系列血管反應(yīng)事件隨之而來，最終導(dǎo)致炎癥和組織修復(fù)[7]。在創(chuàng)傷愈合中炎癥細胞因子在纖維蛋白沉積和降解的平衡中是至關(guān)重要的。炎癥細胞因子的總體作用是改變纖維蛋白沉積和降解的平衡，并有利于纖維形成，其中TGF-β以及IL-8在此過程中發(fā)揮重要的作用。

TGF-β是一種強效的細胞因子，具有調(diào)節(jié)、啟動以及終止組織修復(fù)的作用[8-9]。在粘連的形成中，無論是在動物模型還是體外實驗，TGF-β是目前研究較為明確的炎癥細胞因子之一。研究[10-11]顯示，在動物模型中,術(shù)后創(chuàng)面使用重組TGF-β試劑后，粘連顯著增加；使用TGF-β抑制劑后粘連顯著降低。手術(shù)創(chuàng)傷后TGF-β受體在腹膜組織以及腹膜積液中顯著升高。TGF-β過度表達可直接致組織纖維化，促進纖維粘連的轉(zhuǎn)化[8]。因此，可能會降低早期纖維素滲出的溶解能力，最終導(dǎo)致纖維堆積及膠原沉積促進粘連形成。由此可見，TGF-β是主要的纖維蛋白溶解抑制劑以及纖溶酶原激活物抑制劑。因此，通過抑制TGF-β表達則可促進纖維溶解，降低膠原沉積，最終減輕腸粘連的形成。

IL-8由腹膜間皮分泌，是炎癥細胞高度選擇性趨化因子[12]，可以激活嗜中性粒細胞脫粒。受損的間皮細胞分泌IL-8后促進炎癥細胞的進一步聚集[13]。間皮細胞分泌IL-8后可刺激TNF- α和IL-1的分泌，升高的TNF- α具有較強的抑制腹膜纖溶活性。與無胃腸道穿孔的患者相比，有穿孔患者其腹腔液中IL-8濃度在手術(shù)時增加100倍[14-15]。IL-8在術(shù)后粘連形成的作用的具體機制仍不清楚，可能是通過升高TNF- α及炎癥滲出促進纖維形成最終導(dǎo)致粘連形成。

此外，中醫(yī)藥的理論在調(diào)理術(shù)后機體胃腸道功能及抑制術(shù)后腹腔粘連方面具有確切的療效,越來越多的理念被引入術(shù)后康復(fù)中[16]。芍藥同時具有活血祛瘀作用,可改善腸壁循環(huán),促進腸壁水腫消退和粘連吸收, 增強腸蠕動，從而減少創(chuàng)面間的接觸時間，降低了創(chuàng)面間的纖維沉積。

本實驗顯示，芍藥苷顯著降低了TGF-β、IL-8表達水平，使用芍藥苷后粘連組織炎癥滲出、粘連程度明顯低于模型對照組, 說明芍藥苷對TGF-β、IL-8的表達具有抑制效果，具有良好的抗炎效應(yīng)，從而減輕術(shù)后粘連的形成。TGF-β、IL-8的高表達與纖溶抑制以及纖維形成緊密相關(guān)，本研究顯示，術(shù)后使用芍藥苷粘連形成明顯減少，實驗組大鼠術(shù)后粘連組織中的TGF-β、IL-8表達量均顯著低于對照組(P<0.05)。表明芍藥苷預(yù)防大鼠術(shù)后腸粘連的作用機制可能是抑制TGF-β、IL-8的過度表達、降低纖維蛋白的形成、促進纖溶活性、減少膠原沉積，最終發(fā)揮減輕術(shù)后腸粘連的作用效果。

綜上所述，術(shù)后使用芍藥苷可能通過降低炎癥反應(yīng)與纖維形成致膠原過度沉積，進而減輕術(shù)后腹腔粘連的形成，芍藥苷將有望成為預(yù)防腹腔粘連的新方向。