池永東，陳智慧，邱 翔，鐘紅梅，陳官璐，林亞秋

( 西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041 )

肌肉是由不同代謝特性的平行肌纖維束組成，其多樣性主要由肌纖維的組成和異質(zhì)性決定[1]。肌纖維類型的不同不僅直接影響肌肉的色澤、嫩度、系水力和風(fēng)味，同時在動物屠宰后，不同類型肌纖維中的代謝酶會使肉產(chǎn)生不同的代謝反應(yīng)和生理生化變化，進而影響肉質(zhì)[2]。根據(jù)肌球蛋白重鏈(MyHC)多態(tài)性進行分類，可將肌纖維分為慢速氧化Ⅰ型(MyHCⅠ)、快速氧化Ⅱa型(MyHCⅡa)、快速酵解Ⅱb型(MyHCⅡb)和中間Ⅱx型(MyHCⅡx)四類[3]，Ⅰ型肌纖維含有豐富的肌紅蛋白，血紅蛋白和三磷酸甘油脂，且纖維較細(xì)，故Ⅰ型肌纖維含量高的肉色澤鮮紅，嫩度高，風(fēng)味好，相比之下Ⅱ型肌纖維橫截面積大，肌紅蛋白、血紅蛋白和三磷酸甘油脂的含量均低于Ⅰ型，故Ⅱ型肌纖維含量高的肉品質(zhì)偏低[4]。但在動物生長過程中，一般認(rèn)為出生后肌纖維的總數(shù)保持不變，而肌纖維的類型卻并非固定不變[5]，Schiaffino等[6]發(fā)現(xiàn)，肌纖維類型的轉(zhuǎn)變存在一種固定的模式：Ⅰ?Ⅱa?Ⅱx?Ⅱb，這種模式的轉(zhuǎn)變可為改善動物肉品質(zhì)提供新的指導(dǎo)模式。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子1α(PGC-1α)是目前在肌纖維類型轉(zhuǎn)化研究中較受關(guān)注的轉(zhuǎn)錄輔激活因子，存在于多種脊椎動物中(如哺乳類、鳥類、爬行類和魚類等)[7]。研究者發(fā)現(xiàn)，在刺激PGC-1α表達的情況下可使小鼠骨骼肌和人成肌細(xì)胞中Ⅱ型肌纖維出現(xiàn)Ⅰ型肌纖維的特征[8-10]。但在不同動物中也存在不同的報道，有研究者指出，PGC-1α可使雞胸肌部分Ⅱb型肌纖維轉(zhuǎn)化為Ⅱa型肌纖維，但其他學(xué)者卻發(fā)現(xiàn)該結(jié)論不適用于小鼠[11]。上述研究表明，PGC-1α在肌纖維類型轉(zhuǎn)化中的作用具有物種特異性，但對PGC-1α基因在魚類中的研究較少[12]，尤其是對其在肌纖維類型轉(zhuǎn)化中的作用研究更少。

齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)是青藏高原特有的冷水魚，屬鯉科、裂腹魚亞科。其肌肉中不僅必需氨基酸組成均衡，賴氨酸含量豐富(90.6 g/kg，干質(zhì)量)，且鮮味氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸和甘氨酸)含量較高，占氨基酸總量的35.17%，味道鮮美，深受消費者喜愛[13]。筆者擬從PGC-1α調(diào)控肌纖維類型轉(zhuǎn)化入手來闡明該魚優(yōu)良肉質(zhì)形成的分子機理，由于構(gòu)建PGC-1α的超表達和干擾載體是闡明其調(diào)控作用必不可少的基礎(chǔ)，本研究擬通過基因重組方法構(gòu)建其慢病毒超表達和干擾載體，為最終闡明PGC-1α在齊口裂腹魚肌纖維類型轉(zhuǎn)化中的調(diào)控作用及機制提供重要的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

齊口裂腹魚購自四川省雅安市蘆山縣。

1.1.2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基購自Hyclone公司，胰蛋白酶購自Sigma公司，胎牛血清購自Gemini公司，馬血清購自GIBCO公司，LipofectamineTM3000購自Invitrogen公司，無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒、TaqDNA聚合酶、T4連接酶和感受態(tài)細(xì)胞DH5α均購自天根生化科技有限公司，HpaⅠ、XbaⅠ、XhoⅠ和BamHⅠ內(nèi)切酶購自Thermo公司，293T細(xì)胞和C2C12細(xì)胞由四川大學(xué)生物治療國家重點實驗室贈予。

1.2 方法

1.2.1 齊口裂腹魚FUGW-PGC-1α重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)本實驗室提交到美國國立生物技術(shù)信息中心上的齊口裂腹魚PGC-1α基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物(表1)，以其肌肉組織為模板擴增包含HpaⅠ和XbaⅠ酶切位點的PGC-1α基因序列。25 μL PCR反應(yīng)體系由2×Long Taq PCR Master Mix 12.5 μL、cDNA 1 μL、引物各1 μL、ddH2O 9.5 μL組成。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s、52.3 ℃退火30 s、72 ℃延伸4 min，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后用DNA膠回收試劑盒回收目的條帶，與PMD 19-T載體連接、轉(zhuǎn)化后篩選陽性克隆、測序，測序引物FUGW見表1。將測序正確的pMD-19T重組質(zhì)粒用Hpa Ⅰ和XbaⅠ進行雙酶切進而來純化PGC-1α基因片段，然后與經(jīng)過同樣雙酶切的FUGW-RFP載體用T4 DNA連接酶將進行連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)提取質(zhì)粒雙酶切驗證后送交公司測序。

1.2.2 齊口裂腹魚PsicoR-PGC-1α-shRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)齊口裂腹魚PGC-1α基因序列，利用Invitrogen公司的siRNA在線設(shè)計軟件(https:∥rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/)設(shè)計兩對寡核苷酸干擾靶位點組合(表2)，然后退火形成雙鏈(10×PCR Buffer 1 μL，10 μmol/L的上、下游干擾序列各1 μL，加水至10 μL，經(jīng)過95 ℃ 4 min，70 ℃ 10 min)。隨后與被XhoⅠ/BamHⅠ雙酶切的線性化的pSioR-GFP載體用T4連接酶連接(10×buffer 1 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，Vector 1 μL，Anneal product 7 μL，20 ℃ 1 h)轉(zhuǎn)化DH5α，挑取陽性克隆經(jīng)PCR驗證后送交公司測序，檢測引物PsicoR見表1。

表1 引物序列表

表2 干擾序列表

1.2.3 齊口裂腹魚重組慢病毒質(zhì)粒FUGW-PGC-1α及pSioR-PGC-1α的包裝

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒FUGW-PGC-1α及pSioR-PGC-1α與包裝質(zhì)粒(PSPA與PMD2G)利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至長滿至80%的293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，2000 r/min，10 min離心去除細(xì)胞碎片，0.45 μm濾器過濾收集病毒顆粒。

1.2.4 重組慢病毒載體鑒定

用包裝好的齊口裂腹魚重組慢病毒FUGW-PGC-1α及pSioR-PGC-1α感染長滿至80%的C2C12細(xì)胞，并收集感染72 h的細(xì)胞提取總RNA，利用qPCR檢測超表達和干擾后PGC-1α基因表達的變化(特異引物及內(nèi)參引物見表1)。qPCR總反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex Taq TM(2×)PCR 10 μL，模板cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，加ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，共45個循環(huán)。

1.2.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 齊口裂腹魚重組慢病毒質(zhì)粒FUGW-PGC-1α構(gòu)建

采用RT-PCR的方法擴增得到齊口裂腹魚PGC-1α基因序列2640 bp， 經(jīng)HpaⅠ和XbaⅠ雙酶切后與同樣經(jīng)過酶切的FUGW-RFP載體進行連接轉(zhuǎn)化，然后將構(gòu)建好的FUGW-PGC-1α-RFP重組質(zhì)粒經(jīng)HpaⅠ和XbaⅠ雙酶切后，0.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得兩條線性條帶，大小與預(yù)期一致，為一條大于10 000 bp的條帶與一條2640 bp的條帶(圖1)，經(jīng)測序鑒定為正確的齊口裂腹魚FUGW-PGC-1α-RFP重組質(zhì)粒。

2.2 齊口裂腹魚重組慢病毒PsicoR-shRNA-PGC-1α質(zhì)粒的構(gòu)建

將合成的兩對齊口裂腹魚PGC-1α-shRNA雙鏈與線性化的干擾載體PsicoR-GFP連接后，轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞，取陽性菌液進行測序，成功獲得兩對攜帶PGC-1α基因的重組質(zhì)粒pSioR-PGC-1α。然后利用RT-PCR擴增獲得片段大小約為180 bp的空載體PsicoR和片段大小約為240 bp的重組質(zhì)粒(圖2)，經(jīng)測序后成功構(gòu)建PsicoR-shRNA-PGC-1α干擾。

2.3 病毒包裝

將FUGW-PGC-1α及pSioR-PGC-1α與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24 h后，在顯微鏡下可觀察到明顯的紅色和綠色熒光，48 h時觀察發(fā)現(xiàn)90%以上的細(xì)胞已具有熒光(圖3～圖4)，本試驗在48 h時收集病毒，分裝保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.4 重組慢病毒載體的鑒定

收集分別用包裝好的齊口裂腹魚超表達(FUGW-PGC-1α)和干擾(pSioR-PGC-1α)載體的重組病毒感染C2C12成肌細(xì)胞48 h后的細(xì)胞，qPCR檢測結(jié)果顯示，超表達組PGC-1α基因表達水平極顯著高于對照組(P<0.01)，證明超表達成功(圖5)；轉(zhuǎn)染shRNA1組及shRNA2組PGC-1α基因表達水平極顯著低于對照組(P<0.01)，shRNA1組極顯著高于shRNA2組(P<0.01)，證明兩對干擾序列均能成功干擾PGC-1α基因表達，而shRNA2干擾效果更好(圖6)。

圖1 齊口裂腹魚FUGW-PGC-1α-RFP重組質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ和HpaⅠ雙酶切結(jié)果1：重組質(zhì)粒酶切；M：Marker：SM0331.

圖2 重組PsicoR-shRNA電泳結(jié)果M：D2000；1：空載體；2、3：重組PsicoR-shRNA.

圖3 超表達載體病毒包裝熒光圖a：FUGW-RFP-48 h；b：FUGW-PGC-1α-RFP-48 h.

圖4 干擾載體病毒包裝熒光圖a：PsicoR-GFP-48 h；b：PsicoR-shRNA1-GFP-48 h；c：PsicoR-shRNA2-GFP-48 h.

圖5 PGC-1α慢病毒超表達載體感染C2C12細(xì)胞72 h后PGC-1α表達水平不同字母表示差異極顯著(P<0.01).下同.

圖6 PGC-1α慢病毒干擾表達載體感染C2C12細(xì)胞72 h后PGC-1α表達水平

3 討 論

3.1 齊口裂腹魚PGC-1α慢病毒表達載體構(gòu)建

PGC-1α是PGC-1家族中的一員，該家族是一種核受體轉(zhuǎn)錄輔助共激活因子家族，該家族還包括PGC-1β和PRC(類PGC-1輔助因子)兩個成員[14]。其中PGC-1α是最早在酵母雙雜交體系中作為調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的核受體PPARγ的輔激活因子被發(fā)現(xiàn)[15]。PGC-1β與PGC-1α具有高度相似的基因序列和組織分布，但其調(diào)節(jié)基因表達的能力不同[16]，而PRC與PGC-1α的同源性則比PGC-1α與PGC-1β的同源性低，且目前對其研究也相對較少?；赑GC-1α在其他動物肌纖維類型轉(zhuǎn)化中的作用，擬最終闡明其對齊口裂腹魚成肌細(xì)胞分化和肌纖維類型轉(zhuǎn)化中的調(diào)控作用及機理，而載體構(gòu)建是研究的基礎(chǔ)，本實驗室前期構(gòu)建了齊口裂腹魚PCDNA3.1-PGC-1α超表達載體，但轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的成肌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率很低，不適于后期深入研究，因此本研究選擇了利用基因重組的方法構(gòu)建慢病毒超表達和干擾載體，并且使用的是三質(zhì)粒表達系統(tǒng)，使序列重疊的幾率大大降低。

3.2 慢病毒載體的特點

慢病毒因臨床特點表現(xiàn)為感染后要經(jīng)歷漫長的潛伏期后才表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀而得名，慢病毒載體則是在慢病毒基因組的基礎(chǔ)上敲除其復(fù)制所必需的順式作用原件、輔助蛋白及一些與病毒活性相關(guān)的基因等，再插入目的基因、特異性啟動子等后獲得的一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，目前使用的大多數(shù)慢病毒載體系統(tǒng)均來源于HIV-1[17]。常用的病毒載體有腺病毒載體、皰疹病毒載體、痘病毒載體等，與這些病毒載體相比，慢病毒載體因具備更多優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用，慢病毒載體介導(dǎo)的基因可以整合到宿主細(xì)胞的基因組中，較一些真核表達質(zhì)粒效果更加穩(wěn)定；此外，慢病毒載體不僅能感染正在分裂的細(xì)胞，還具有感染分裂靜止期甚至已分化細(xì)胞的能力[18]，這一優(yōu)點有利于對一些喪失分裂能力的細(xì)胞(如本試驗所用的成肌細(xì)胞)的研究。慢病毒載體還具備攜帶5 kb甚至更長的目的片段以及具有更廣泛宿主范圍等優(yōu)點[19]。本試驗成功構(gòu)建了齊口裂腹魚PGC-1α重組慢病毒超表達和干擾載體，發(fā)現(xiàn)可使目的基因被顯著超表達和干擾，這為后續(xù)揭示PGC-1α調(diào)控齊口裂腹魚肌纖維類型轉(zhuǎn)化的機理提供重要的數(shù)據(jù)。