曾凱東 謝蓮娜 劉燦章 蔣夢(mèng) 王麗君 魏顯敬 解澤宙 王凱君

微血管功能障礙廣泛存在于急性心肌梗死及再灌注治療中［1］。肢體遠(yuǎn)隔缺血適應(yīng)（remote ischemic conditioning，RIC）是一種新穎的治療方案，通過(guò)對(duì)遠(yuǎn)隔靶器官遠(yuǎn)端組織實(shí)施短暫反復(fù)的缺血適應(yīng)，從而對(duì)靶器官的再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。已有多項(xiàng)研究表明，肢體RIC可有效減少心肌酶學(xué)梗死面積，從而減少心肌缺血再灌注損傷［2-5］。肢體RIC通過(guò)釋放分子量＜15×103Da的疏水性體液因子經(jīng)血循環(huán)至心臟產(chǎn)生保護(hù)作用［6］。亞硝酸鹽（Nitrite）分子量大概為69 Da，具有穩(wěn)定的疏水結(jié)構(gòu)。在低氧情況下，血紅蛋白可以催化Nitrite使其還原為一氧化氮（NO）。NO具有擴(kuò)張血管作用，可以調(diào)節(jié)組織和器官的血液供應(yīng)，對(duì)氧化應(yīng)激、血小板黏附、白細(xì)胞聚集有抑制作用［7-8］。有研究證實(shí)，健康人實(shí)施肢體遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)后，血漿Nitrite水平顯著升高，將該血漿注入急性心肌梗死老鼠心臟組織，能有效減少老鼠心肌梗死面積［9］。本研究旨在通過(guò)觀察肢體RIC對(duì)行直接經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）的急性ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI）患者校正的TIMI幀數(shù)（corrected TIMI frame count，CTFC）、ST段回落率（fall rate of ST segment，STR）及血清Nitrite水平的影響，探討肢體RIC是否通過(guò)增加外周血循環(huán)Nitrite水平，改善成功行PCI的STEMI患者冠狀動(dòng)脈微循環(huán)灌注。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象及分組

1.1.1 研究對(duì)象 連續(xù)入選2016年1月至2017年7月在大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院循環(huán)四科接受PCI的STEMI患者。STEMI診斷標(biāo)準(zhǔn)：缺血性胸痛持續(xù)30 min以上，休息或含服硝酸甘油后癥狀不能緩解；心電圖相鄰2個(gè)導(dǎo)聯(lián) ST 段抬高＞0.1 mV（V2～V3導(dǎo)聯(lián) ST 段抬高＞0.2 mV）；心肌壞死標(biāo)志物（肌鈣蛋白或肌酸激酶同工酶）大于正常范圍2倍以上。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合STEMI診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）年齡18～80歲；（3）冠狀動(dòng)脈造影示梗死相關(guān)動(dòng)脈（infarct related artery，IRA）為閉塞性病變，IRA遠(yuǎn)段無(wú)側(cè)支循環(huán)；（4）持續(xù)性胸痛開(kāi)始至IRA血流再灌注≤12 h；（5）同意參與本研究患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往明確陳舊性心肌梗死；（2）已知嚴(yán)重的外周動(dòng)脈疾病；（3）惡性腫瘤；（4）合并腎病并導(dǎo)致嚴(yán)重腎功能不全（血清肌酸酐＞353 μmol/L）；（5）并發(fā)心搏驟停、心源性休克；（6）罪犯血管未成功開(kāi)通者；（7）術(shù)后退出本研究患者。本研究獲得大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)?；颊呔炇鹬橥鈺?shū)。

1.1.2 分組 根據(jù)患者心電圖ST段抬高導(dǎo)聯(lián)劃分為前壁心肌梗死和非前壁心肌梗死兩部分患者，按照患者入院的先后順序排列，采用隨機(jī)數(shù)字表法產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)字序列，按照2 ∶ 1原則分別納入肢體RIC組（50例）及對(duì)照組（25例）。隨機(jī)數(shù)字表由IBM SPSS Statistics 19.0軟件包生成。肢體RIC組行直接PCI聯(lián)合肢體RIC操作，對(duì)照組將袖帶綁好后不進(jìn)行加壓操作，僅行直接PCI。

1.2 直接PCI術(shù)

患者到達(dá)醫(yī)院急診科完成12/18導(dǎo)聯(lián)心電圖，明確STEMI診斷后，立即給予阿司匹林300 mg嚼服、氯吡格雷600 mg或替格瑞洛180 mg及阿托伐他汀40 mg口服，并直接送入導(dǎo)管室，行冠狀動(dòng)脈造影檢查，明確IRA后，即刻行PCI開(kāi)通IRA。PCI術(shù)中的具體操作包括是否進(jìn)行血栓抽吸、球囊及支架大小等由術(shù)者決定。PCI成功標(biāo)準(zhǔn)：殘余狹窄≤30%，TIMI血流Ⅱ～Ⅲ級(jí)且無(wú)急性并發(fā)癥。術(shù)后根據(jù)患者病情及相關(guān)指南推薦應(yīng)用藥物。

1.3 肢體RIC操作方法

對(duì)肢體RIC組患者于送入導(dǎo)管室取完術(shù)前血標(biāo)本后開(kāi)始實(shí)施肢體RIC：在右下肢距膝關(guān)節(jié)上方3～5 cm處綁縛無(wú)創(chuàng)血壓袖帶，充氣加壓至220 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）以阻斷下肢血流，以足背動(dòng)脈搏動(dòng)消失為準(zhǔn)。充氣5 min，放氣5 min，交替循環(huán)直至血管開(kāi)通。血管開(kāi)通時(shí)未完成三個(gè)循環(huán)者繼續(xù)至完成三次循環(huán)。對(duì)照組進(jìn)行常規(guī)PCI，不進(jìn)行肢體RIC操作。

1.4 血標(biāo)本采集、處理與保存

于PCI術(shù)前及術(shù)后即刻經(jīng)動(dòng)脈鞘取動(dòng)脈血2 ml，置于惰性分離膠促凝管中，以3500 r/min離心10 min，取血清于200 μl EP管中，于–80℃冰箱保存，用于檢驗(yàn)血清Nitrite水平。

1.5 CTFC

TIMI幀數(shù)即冠狀動(dòng)脈對(duì)比劑從動(dòng)脈起始充盈至遠(yuǎn)段分支的造影影像幀數(shù)。近端第一幀要求：（1）對(duì)比劑完全充盈動(dòng)脈起始段的寬度；（2）對(duì)比劑必須充盈動(dòng)脈的兩個(gè)邊緣；（3）對(duì)比劑有前向運(yùn)動(dòng)。記錄動(dòng)脈遠(yuǎn)段標(biāo)志：（1）前降支遠(yuǎn)段分叉部位如胡須狀、草叉狀、鯨尾狀；（2）回旋支為包括罪犯病變?cè)趦?nèi)的鈍緣支最遠(yuǎn)端分叉；（3）右冠狀動(dòng)脈為后側(cè)支動(dòng)脈的第一分支。計(jì)幀體位：前降支和回旋支常在左前斜位或右前斜位加足位觀察最佳，右冠狀動(dòng)脈常在左前斜位加頭位觀察最佳。測(cè)定最末幀時(shí)直至血管遠(yuǎn)段顯影消失，其前一幀即為最末幀。前降支由于血管較長(zhǎng)，故計(jì)幀幀數(shù)除以 1.7 為其CTFC。由 2 位資深介入醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行計(jì)幀，影像采集速度為30幀/s，CTFC 取其均值。用CTFC評(píng)價(jià)冠狀動(dòng)脈微循環(huán)水平灌注。

1.6 STR

直接PCI術(shù)前及術(shù)后1 h內(nèi)行12導(dǎo)聯(lián)心電圖檢查。以PCI術(shù)前ST段抬高幅度最大的導(dǎo)聯(lián)為測(cè)量對(duì)象，采用“J”點(diǎn)后80 ms測(cè)定ST段偏移情況。根據(jù)公式［STR=（術(shù)前ST段抬高值–術(shù)后l h ST段抬高值）／術(shù)前ST段抬高值×100%］計(jì)算單一導(dǎo)聯(lián)STR，STR≥70%定義為完全回落，STR＜70%定義為未完全回落。

1.7 血清Nitrite水平測(cè)定

將標(biāo)本從–80℃冰箱取出，在室溫下進(jìn)行解凍，使用南京建成生物有限公司的Nitrite試劑盒，通過(guò)酶標(biāo)儀讀取光密度（optical density，OD）值檢測(cè)血清中Nitrite水平，具體步驟如下。

（1）加樣：①在空白管中加入0.3 ml蒸餾水，依次加入0.8 ml 1號(hào)試劑、0.4 ml 2號(hào)試劑；②于標(biāo)準(zhǔn)管中加入0.3 ml 100 μmol/L Nitrite，依次加入0.8 ml 1號(hào)試劑、0.4 ml 2號(hào)試劑；③在測(cè)定管中加入0.3 ml 樣品，依次加入0.8 ml 1號(hào)試劑、0.4 ml 2號(hào)試劑。（2）離心、顯色、檢測(cè)：將三種管中藥品混勻后放置10 min，以3500 r/min離心10 min，取澄清的上清液0.8 ml，然后加入0.4 ml顯色劑混勻，進(jìn)行顯色，靜置15 min后，采用波長(zhǎng)為550 nm測(cè)各管OD值。（3）計(jì)算Nitrite實(shí)際濃度：血清中Nitrite濃度=（測(cè)定OD值–空白OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD值–空白OD值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)（最小值，最大值）表示，組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用例（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性用Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行分析。采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基線(xiàn)資料情況比較

兩組患者年齡、性別、吸煙史、糖尿病、高血壓病、病變支數(shù)、IRA、替羅非班、血栓抽吸、術(shù)后TIMI血流分級(jí)比例及胸痛至再灌注時(shí)間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，表1）。

2.2 兩組患者觀察指標(biāo)情況比較

肢體RIC組CTFC顯著低于對(duì)照組［（18.12±6.4）幀比（26.04±8.55）幀，p＜0.001］，而STR≥70%百分率顯著高于對(duì)照組（88% 比64%，P=0.014），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1～2）。對(duì)照組患者Nitrite水平手術(shù)前后比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.130）；而肢體RIC組患者Nitrite水平術(shù)后顯著大于術(shù)前［（16.22±4.96）μmol/L比（10.55±4.37）μmol/L，p＜0.001］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組患者術(shù)前Nitrite水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.606），而RIC組患者術(shù)后Nitrite水平顯著高于對(duì)照組［（16.22±4.96）μmol/L比（13.01±4.16）μmol/L，P=0.007］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2、圖3）。

2.3 肢體RIC組Nitrite水平與CTFC相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示，肢體RIC組術(shù)后血清Nitrite水平與CTFC呈負(fù)相關(guān)（r=–0.447，P=0.001；圖4）。

表1 兩組患者基線(xiàn)資料比較

3 討論

冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙包括內(nèi)皮功能障礙、平滑肌功能障礙、管腔阻塞（微栓塞），最終會(huì)導(dǎo)致心肌組織灌注不足引發(fā)一系列不良后果［10-11］。在急性心肌梗死患者中，冠狀動(dòng)脈微循環(huán)破壞性改變主要表現(xiàn)為炎癥和增生［12］。心肌細(xì)胞內(nèi)/間質(zhì)突然發(fā)生水腫是由再灌注引起的最早形態(tài)學(xué)改變，因?yàn)榻M織水腫可能會(huì)壓迫微血管床，在最初的2～10 min氧自由基產(chǎn)物達(dá)到峰值，進(jìn)而損傷血管內(nèi)皮。連鎖反應(yīng)會(huì)釋放出自由基和血管活性物質(zhì)，隨后出現(xiàn)冠狀動(dòng)脈收縮增強(qiáng)進(jìn)而引起微血管痙攣，進(jìn)一步阻礙冠狀動(dòng)脈血流。在心肌梗死前15 h內(nèi)，部分毛細(xì)血管特別是小靜脈血管麻痹擴(kuò)張，部分毛細(xì)血管、小動(dòng)脈和前毛細(xì)血管管腔狹窄。此期間血管滲透壓升高，血漿滲出，白細(xì)胞增多，單核細(xì)胞和紅細(xì)胞滲出。在缺血心肌再灌注5 h后，微循環(huán)被大量白細(xì)胞阻塞，血管局部用晶體液灌注對(duì)于該阻塞無(wú)緩解作用［13］。CTFC被用于評(píng)價(jià)急性冠狀動(dòng)脈綜合征冠狀動(dòng)脈造影的結(jié)果，作為一個(gè)簡(jiǎn)單而且更加客觀的連續(xù)性變量指標(biāo)，可以作為評(píng)價(jià)STEMI患者PCI術(shù)后心肌血流真正灌注的手段之一［14］。STR是代表IRA是否再通，可以預(yù)示心肌水平的有效再灌注［15］。CTFC聯(lián)合STR可較好地評(píng)價(jià)心肌灌注水平。有研究顯示，肢體RIC會(huì)減少急性心肌梗死患者心肌梗死面積、CTFC、再灌注惡性心律失常發(fā)生率，增加左心室射血分?jǐn)?shù)、STR［16-17］。在本研究中，肢體RIC組有效減少CTFC及增加STR，符合其保護(hù)作用機(jī)制。

表2 兩組患者術(shù)前及術(shù)后血清Nitrite水平比較（μmol/L ，

表2 兩組患者術(shù)前及術(shù)后血清Nitrite水平比較（μmol/L ，

注：Nitrite，亞硝酸鹽；RIC，遠(yuǎn)隔缺血適應(yīng)

項(xiàng)目 對(duì)照組 肢體RIC組 P值術(shù)前 11.09±4.01 10.55±4.37 0.606術(shù)后 13.01±4.16 16.22±4.96 0.007 P值 0.130 ＜0.001

圖3 兩組患者術(shù)前與術(shù)后血清Nitrite水平比較

圖1 兩組患者CTFC比較

圖2 兩組患者STR≥70%百分率比較

圖4 肢體RIC組術(shù)后血清Nitrite水平與CTFC相關(guān)性

在氧含量充足情況下，一氧化氮合酶（NOS）對(duì)NO的生成起著重要作用，精氨酸在NOS催化下生成NO和瓜氨酸。而在缺氧情況下，由于氧獲取受限，NOS作用受抑制，Nitrite成為生成NO的重要底物，是體內(nèi)NO的生物儲(chǔ)存庫(kù)。Nitrite通過(guò)一系列機(jī)制轉(zhuǎn)化成NO，轉(zhuǎn)化機(jī)制包括黃嘌呤氧化還原酶的催化作用、非酶的歧化反應(yīng)、別構(gòu)控制血紅蛋白還原酶的催化反應(yīng)。在缺血提供的缺氧和酸性環(huán)境下，這些機(jī)制更容易促使Nitrite向NO轉(zhuǎn)化［18］。缺血再灌注損傷在微循環(huán)障礙方面主要表現(xiàn)在血管內(nèi)皮受損及痙攣所致的血管阻力增加，使白細(xì)胞黏附和血小板聚集，促進(jìn)微血栓形成，加重組織缺氧。Nitrite在心肌缺氧環(huán)境下轉(zhuǎn)化成NO后，修復(fù)血管內(nèi)皮功能及擴(kuò)張微血管，減少微血管阻力，從而抑制血小板聚集、活性氧產(chǎn)生、白細(xì)胞黏附等炎癥反應(yīng)，抑制微血栓的形成。Gonzalez等［19］對(duì)狗心臟結(jié)扎制造缺血再灌注模型，通過(guò)磁共振成像檢查發(fā)現(xiàn)，往靜脈內(nèi)注入Nitrite能夠改善冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙，抑制心內(nèi)膜下的無(wú)復(fù)流現(xiàn)象。Liu等［20］構(gòu)建了心肌缺血再灌注豬模型，發(fā)現(xiàn)吸入NO可改善梗死區(qū)心內(nèi)膜及心外膜的血供，且減少白細(xì)胞浸潤(rùn)，得出冠狀動(dòng)脈再灌注之前或再灌注期間吸入NO可顯著改善微血管循環(huán)，減少梗死面積的結(jié)論。

有研究顯示，在急性心肌梗死時(shí)，Nitrite水平會(huì)降低，而再灌注后Nitrite水平在短時(shí)間內(nèi)仍是降低的，但隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，Nitrite水平會(huì)相應(yīng)增高［21］。在本研究中，對(duì)照組手術(shù)前后Nitrite水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該現(xiàn)象可能由于患者數(shù)較少，不足以得出確切結(jié)論。

有研究發(fā)現(xiàn)，在人體上實(shí)施肢體預(yù)適應(yīng)后，血漿Nitrite水平顯著升高［7］。另有研究對(duì)老鼠急性心肌梗死模型實(shí)施肢體遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)后，發(fā)現(xiàn)血漿Nitrite水平亦顯著升高［22］。本研究中肢體RIC組術(shù)后Nitrite水平高于術(shù)前，且高于對(duì)照組術(shù)后Nitrite水平，更能除外急性心肌梗死和再灌注對(duì)Nitrite水平的影響，考慮肢體RIC會(huì)增加外周循環(huán)血中Nitrite水平。通過(guò)Pearson相關(guān)系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，肢體RIC組Nitrite水平與CTFC呈負(fù)相關(guān)，而CTFC減少代表著術(shù)后微循環(huán)灌注水平的提升。因而表明肢體RIC能夠通過(guò)升高外周血循環(huán)Nitrite水平來(lái)改善STEMI直接PCI患者術(shù)后的微循環(huán)灌注。

本研究為單中心小型臨床試驗(yàn)，樣本量較小，有關(guān)肢體RIC對(duì)急性心肌梗死患者冠狀動(dòng)脈微循環(huán)的影響以及肢體RIC所致血清Nitrite水平變化的臨床意義，需更大規(guī)模的臨床研究進(jìn)一步探討。