單春蘭，劉超英，孫文匯，富國(guó)文，高 洪，嚴(yán)玉霖，景麟稀

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,云南昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,云南昆明 650201)

蘇丹紅Ⅰ(Sudan Ⅰ)是一種人工合成的親脂性偶氮化合物，常用作化工染料，由于其對(duì)人體健康具有潛在危險(xiǎn)性，已被禁止作為食品、藥品添加劑使用，但還有不良商家在市場(chǎng)上出售含蘇丹紅的食品，引起世界對(duì)蘇丹紅染料的廣泛關(guān)注[1]。Sudan Ⅰ 可由多種途徑進(jìn)入生物體內(nèi)，在消化道微生物還原酶以及肝臟及肝外組織微粒體和細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞色素還原酶[如細(xì)胞色素P450s(cytochrome P450s,CYPs)]等的作用下進(jìn)行代謝[2]。代謝產(chǎn)物對(duì)機(jī)體均有較明顯的損傷作用，有極強(qiáng)的穿透性，能夠滲透機(jī)體血紅細(xì)胞，具有遺傳毒性和致癌性，對(duì)許多器官和組織包括肝、腎、肺、心臟以及生殖器官造成損傷，引發(fā)多種疾病，同時(shí)增加機(jī)體癌變的幾率。CYP 450s是某些外源性和內(nèi)源性化合物的重要Ⅰ相代謝酶，主要存在肝微粒體及小腸中，其中CYP 1A家族細(xì)胞色素CYP 1A1能代謝活化多種環(huán)境致癌物和致突變物，并參與氧化一系列結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)的化合物，如多環(huán)芳烴類(lèi)化合物、外源化合物、脂肪酸、二甲基苯并蒽等[3-4]；CYP2家族細(xì)胞色素中CYP 2E1可被乙醇等化合物誘導(dǎo)，是參與多種前致癌物代謝為終致癌物的主要酶類(lèi)，介導(dǎo)藥物之間的互相作用[5-7]。

目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)Sudan Ⅰ的研究主要集中在食品中檢測(cè)方法和對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞的遺傳毒性、氧化性損傷等方面，而對(duì)Sudan Ⅰ在體內(nèi)的毒性機(jī)制特別從組織病理學(xué)角度的研究報(bào)道極少。本試驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)和原位雜交(in situ hybridization，ISH)技術(shù)檢測(cè)經(jīng)Sudan Ⅰ處理的大鼠十二指腸CYP 1A1和CYP 2E1表達(dá)的變化，探討Sudan Ⅰ的毒性和致病機(jī)理，從比較病理學(xué)角度為Sudan Ⅰ對(duì)人和動(dòng)物健康可能造成的影響具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 蘇丹紅Ⅰ，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；焦炭酸二乙酯(diethylprocarbonate，DEPC)，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；CYP 1A1多克隆抗體，購(gòu)于上海晶天生物科技有限公司；CYP 2E1多克隆抗體、SABC(兔IgG)-POD試劑盒、濃縮型DAB試劑盒、CYP 1A1 mRNA原位雜交試劑盒、CYP 2E1mRNA原位雜交試劑盒、原位雜交專(zhuān)用PBS、2×SSC緩沖液及原位雜交專(zhuān)用蓋玻片，購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；APES，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；二甲苯、無(wú)水乙醇、丙酮、甲醛，購(gòu)于北京化工廠；石蠟，購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蘇木精，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司；PBS(pH7.4)、枸櫞酸緩沖液、梯度濃度酒精等試劑為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.2 主要儀器 Leica(RM 2235)輕軌石蠟切片機(jī)購(gòu)自德國(guó) Leica公司；Olympus CX41顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；Image-pro Plus 5.1圖像分析軟件為美國(guó) Media Cybernetics公司產(chǎn)品；Motic BA400病理圖像分析儀購(gòu)自Moticam公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 30只健康清潔級(jí)SD大鼠，體重140 g～160 g，雌(無(wú)孕)雄不拘，由昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供。臨床檢查確認(rèn)健康后，提前獨(dú)籠隔離預(yù)飼養(yǎng)3 d，自由飲水采食，編號(hào)并隨機(jī)分為Sudan Ⅰ處理組(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ組)和空白對(duì)照組(C組)，每組6只。將Sudan Ⅰ與飼料按一定比例充分混勻，配制成4個(gè)不同劑量的顆粒飼料，分別飼喂Sudan Ⅰ處理組：Ⅰ組(265 mg/kg)、Ⅱ組(530 mg/kg)、Ⅲ組(795 mg/kg)和 Ⅳ組(975 mg/kg)，連續(xù)飼喂10 d。C組飼以普通顆粒飼料，飼喂與處理組相同天數(shù)。

1.2.2 樣品采集 飼喂10 d后，大鼠放血致死，迅速截取十二指腸組織樣，一部分樣品用于ISH試驗(yàn)，浸泡于用DEPC處理的40 mL/L多聚甲醛PBS液中固定，采集過(guò)程嚴(yán)禁RNase污染；另一部分十二指腸用于IHC試驗(yàn)，PBS清洗食糜，清除多余液體，40 mL/L多聚甲醛固定。

1.2.3 十二指腸中CYP 1A1和CYP 2E1基因表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測(cè) 將固定好的十二指腸樣品包埋，制作成石蠟切片，厚度4 μm，根據(jù)試劑盒提供SABC法步驟染色：脫蠟，復(fù)水，去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，抗原修復(fù)，血清封閉，CYP 1A1/CYP 2E1多克隆抗體4℃過(guò)夜，IgG孵育，生物素SABC標(biāo)記，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，水化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。鏡檢可見(jiàn)，細(xì)胞核呈藍(lán)色或淺藍(lán)色，陽(yáng)性標(biāo)記呈黃褐色或紅褐色。

1.2.4 十二指腸中CYP 1A1 mRNA和CYP 2E1 mRNA表達(dá)的原位雜交檢測(cè) 將DEPC處理的固定液固定好后的十二指腸制做石蠟切片，厚度6 μm，根據(jù)原位雜交試劑盒提供步驟染色：依次進(jìn)行脫蠟，復(fù)水，H2O2液滅活內(nèi)源性酶，胃蛋白酶消化以暴露CYP 1A1 mRNA/CYP 2E1 mRNA核酸片段，室溫下10 mL/L多聚甲醛PBS液中固定10 min，預(yù)雜交液孵育，40℃雜交過(guò)夜，2×SSC緩沖液、0.5×SSC緩沖液和0.2×SSC緩沖液梯度洗滌；血清封閉，生物素化鼠抗地高辛抗體孵育，SABC液孵育，生物素化過(guò)氧化物酶孵育，DAB顯色，自來(lái)水沖洗，蘇木精復(fù)染，分化，氨水返藍(lán)，脫水，透明，封片。鏡檢可見(jiàn)，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞胞漿中ISH陽(yáng)性標(biāo)記呈棕褐色或棕黃色。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理及分析 IHC試驗(yàn)：10×40倍顯微鏡下，每個(gè)樣品隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀察陽(yáng)性標(biāo)記物的分布情況，并使用Image-Pro Plus 5.1測(cè)定以上樣品陽(yáng)性物質(zhì)所占IOD值(Integrated optical density,IOD)，利用SPSS19.0軟件進(jìn)行均數(shù)運(yùn)算和方差分析，對(duì)各試驗(yàn)組和對(duì)照組數(shù)據(jù)之間進(jìn)行差異顯著性分析。 ISH試驗(yàn)：顯微鏡下觀察，隨機(jī)對(duì)每個(gè)樣品選取5個(gè)視野進(jìn)行圖像采集，并用圖像分析軟件Motic Med 6.0A中的“免疫組化圖像自動(dòng)分析”模塊對(duì)CYP 2E1mRNA陽(yáng)性信號(hào)的IOD值進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 十二指腸CYP 1A1和CYP 2E1基因表達(dá)的情況

十二指腸CYP 1A1和CYP 2E1基因表達(dá)的IOD值見(jiàn)表1。免疫組化試驗(yàn)檢測(cè)十二指腸CYP 1A1基因表達(dá)水平見(jiàn)圖1。

表1 大鼠CYP 1A1與CYP 2E1靶基因的mRNA序列

從表2和圖1中可見(jiàn)，C組與Sudan Ⅰ處理組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組)十二指腸CYP 1A1基因表達(dá)的IOD值分別是94.509 73、254.078 17、345.333 22、593.373 43、502.872 22，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和 Ⅳ組CYP 1A1在一定劑量范圍內(nèi)IOD值呈上升趨勢(shì)，極顯著高于C組(P<0.01)。圖1可以看出，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和 Ⅳ組十二指腸CYP 1A1基因的表達(dá)量較C組增加，Ⅲ、Ⅳ組十二指腸細(xì)胞出現(xiàn)的陽(yáng)性標(biāo)記高于Ⅰ、Ⅱ組，Ⅳ組棕色陽(yáng)性標(biāo)記較 Ⅲ組有所減少。表明Sudan Ⅰ處理組十二指腸CYP 1A1基因表達(dá)量與C組相比顯著增加(P<0.01)，且在一定劑量范圍內(nèi)隨著Sudan Ⅰ劑量的上升而增加。免疫組化試驗(yàn)檢測(cè)十二指腸CYP 2E1基因表達(dá)水平見(jiàn)圖2。

A～E.依次為C組、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組中十二指腸CYP 1A1基因的表達(dá)情況(IHC,400×); (箭頭為陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞)A-E.The expressions of CYP 1A1 gene in C group,Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ and Ⅳ groups,respectively (IHC,400×); (Arrow:positive cells)

A～E：依次為C組、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組中十二指腸CYP 2E1基因的表達(dá)情況(IHC,400×); (箭頭：陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞)A-E.The expressions of CYP 2E1 gene in C group,Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ and Ⅳ groups,respectively (IHC,400×); (Arrow:positive cells)

組別 GroupsCYP 1A1CYP 2E1C94.50973±22.40165.89946±32.58Ⅰ254.07817±13.47??273.57168±12.41??Ⅱ345.33322±11.39??354.12282±19.27??Ⅲ593.37343±29.64??716.13183±13.41??Ⅳ502.87222±38.66??567.62503±19.22??

注：與C組比較：**P<0.01；*P<0.05 。

Note:**P<0.01,*P<0.05,VS control group.

免疫組化結(jié)果顯示(表2和圖2)，C組與Sudan Ⅰ處理組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組)十二指腸CYP 2E1基因表達(dá)的IOD值分別是165.899 46、273.571 68、354.122 82、716.131 83、567.625 03，Sudan Ⅰ處理組CYP 2E1的IOD值在一定劑量范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，極顯著高于C組(P<0.01)。圖2可見(jiàn)，Ⅰ 、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組十二指腸CYP 2E1基因的表達(dá)與C組相比明顯增多，Ⅲ、Ⅳ組十二指腸細(xì)胞出現(xiàn)的陽(yáng)性標(biāo)記高于Ⅰ、Ⅱ組， Ⅳ組棕色陽(yáng)性標(biāo)記較 Ⅲ組有所減少。Sudan Ⅰ處理組十二指腸CYP 2E1基因表達(dá)量與C組相比均極顯著增加(P<0.01)，且在一定劑量范圍內(nèi)隨著Sudan Ⅰ劑量上升而增加。

2.2 十二指腸CYP 1A1和CYP 2E1 mRNA表達(dá)水平變化情況

十二指腸CYP 1A1和CYP 2E1 mRNA表達(dá)的IOD值見(jiàn)表3。十二指腸CYP 1A1 mRNA表達(dá)的原位雜交結(jié)果見(jiàn)圖3。C組與Sudan Ⅰ處理組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和 Ⅳ組)十二指腸CYP 1A1 mRNA表達(dá)蛋白的IOD值分別是153.694 32、202.447 71、330.448 24、535.825 83、489.731 87，Sudan Ⅰ處理組十二指腸CYP 1A1 mRNA表達(dá)量均極顯著高于C組(P<0.01)，且隨著Sudan Ⅰ劑量的增加而增加。 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組CYP 1A1mRNA的IOD值在試驗(yàn)劑量范圍隨濃度增加而呈上升趨勢(shì)，極顯著高于C組(P<0.01)。 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組十二指腸CYP 1A1 mRNA的表達(dá)與C組相比明顯增多，Ⅲ、Ⅳ組十二指腸細(xì)胞胞漿出現(xiàn)的陽(yáng)性標(biāo)記高于 Ⅰ、Ⅱ組， Ⅳ組棕色陽(yáng)性標(biāo)記較 Ⅲ組有所減少。Sudan Ⅰ處理組十二指腸CYP 1A1 mRNA表達(dá)量均極顯著高于C組(P<0.01)，且隨著Sudan Ⅰ劑量的上升而增加。表明Sudan Ⅰ能夠誘導(dǎo)十二指腸CYP 1A1基因在RNA水平的表達(dá)的增加。十二指腸CYP 2E1 mRNA表達(dá)的原位雜交結(jié)果見(jiàn)圖4。

表3 十二指腸CYP1A1 mRNA，CYP 2E1 mRNA的IOD值

注：與C組比較：**P<0.01；*P<0.05 。

Note:**P<0.01,*P<0.05,VS control group.

A～E.依次為C組、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組中十二指腸CYP 1A1 mRNA的表達(dá)情況(IHC,400×); 箭頭為陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞A-E.The expressions of CYP 1A1 mRNA in C group,Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ and Ⅳ groups respectively (IHC,400×); Arrow:positive cells

A～E.依次為C組、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組中十二指腸CYP 2E1mRNA的表達(dá)情況(IHC,400×); 箭頭：陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞A-E.The expressions of CYP 2E1mRNA in C group,Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ and Ⅳ groups respectively (IHC,400×); Arrow:positive cells

原位雜交結(jié)果顯示(表3和圖4)，在C組和Sudan Ⅰ處理組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和 Ⅳ組)十二指腸CYP 2E1 mRNA表達(dá)的IOD值分別是122.949 71、204.033 52、266.951 41、537.112 98、425.354 66，Sudan Ⅰ處理組十二指腸CYP 2E1 mRNA表達(dá)量均極顯著高于C組(P<0.01)，且隨著Sudan Ⅰ劑量的上升而增加。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和 Ⅳ組CYP 2E1mRNA的IOD值在一定劑量范圍內(nèi)呈增長(zhǎng)的趨勢(shì)，極顯著高于C組(P<0.01)。圖4顯示，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組十二指腸CYP 2E1 mRNA的表達(dá)與C組相比明顯增多，Ⅲ、Ⅳ組十二指腸細(xì)胞胞漿出現(xiàn)的陽(yáng)性標(biāo)記高于 Ⅰ、Ⅱ組，Ⅳ組黃棕色陽(yáng)性標(biāo)記較 Ⅲ組有所減少。Sudan Ⅰ處理組十二指腸CYP 2E1 mRNA表達(dá)量均極顯著高于C組(P<0.01)，且隨著Sudan Ⅰ劑量的上升而增加。本試驗(yàn)結(jié)果也表明Sudan Ⅰ能夠誘導(dǎo)十二指腸CYP 2E1基因在RNA水平的表達(dá)的增加。

3 討論

蘇丹紅能夠使體內(nèi)相關(guān)酶系統(tǒng)激活，并被其催化分解為多種代謝產(chǎn)物，部分代謝產(chǎn)物能夠損傷細(xì)胞內(nèi)核，或與DNA、RNA形成化合物，根據(jù)前人進(jìn)行的大量體外致突變?cè)囼?yàn)與動(dòng)物性試驗(yàn)證明，蘇丹紅對(duì)動(dòng)物機(jī)體具有致突變性作用。研究發(fā)現(xiàn)大部分Sudan Ⅰ毒性效應(yīng)的發(fā)揮都與CYP 1A1密切相關(guān)，主要是與DNA形成加合物[8]。一般認(rèn)為外源性物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后，如果CYP 1A1參與了該物質(zhì)在機(jī)體內(nèi)的代謝，那么CYP 1A1基因表達(dá)量就會(huì)上升，此時(shí)就可以認(rèn)為該物質(zhì)具有誘導(dǎo)CYP 1A1的作用，CYP 1A1表現(xiàn)為酶活性的增強(qiáng)。嚴(yán)玉霖等[9]報(bào)道,Sudan Ⅰ 能夠引起肝臟組織細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，能夠顯著上調(diào)大鼠肝臟 CYP 1A1 基因的表達(dá),從而促進(jìn) Sudan Ⅰ在體內(nèi)代謝成有毒物質(zhì)。

CYP450s酶系是由許多同工酶構(gòu)成的超基因大家族，是致癌物代謝活化的重要酶系之一。在哺乳動(dòng)物內(nèi)CYP450s家族廣泛分布于肝、胃腸道、腎、肺、皮膚及胎盤(pán)等組織[10]。臨床上，許多藥物通過(guò)CYP 1A2、CYP 2E1代謝或轉(zhuǎn)化(活化)，如咖啡因、對(duì)乙酰氨基酚、三氟溴氯乙烷等[11]。孫恒祥等[12]發(fā)現(xiàn)，CYP 1A1 MspI位點(diǎn)多態(tài)性與口腔癌易感性呈顯著相關(guān)，攜帶m1等位基因的個(gè)體患癌風(fēng)險(xiǎn)可能會(huì)相對(duì)減小。CYP 2E1基因Rsa Ⅰ多態(tài)影響結(jié)直腸癌的易感性，CYP 2E1 c2/c2基因型增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[13]。還有研究表明，CYP 2E1(96 bp位點(diǎn))能增加胃癌易感性的風(fēng)險(xiǎn)[14]。小腸不僅是營(yíng)養(yǎng)素和水最初的吸收器官，一些外源物質(zhì)經(jīng)小腸代謝成對(duì)機(jī)體有毒的物質(zhì)，此過(guò)程中在小腸內(nèi)支配代謝作用的系統(tǒng)是CYP 450、CYP 1A1和CYP 2E1在外源物在體內(nèi)的代謝過(guò)程中具有舉足輕重的作用。有研究證明CYP 1A1、CYP 2E1基因在十二指腸表達(dá)顯著[15]，所以研究十二指腸CYP 1A1、CYP 2E1基因表達(dá)的變化具有重要意義。

在一定劑量范圍內(nèi)，Sudan Ⅰ 能夠誘導(dǎo)大鼠十二指腸CYP 1A1、CYP 2E1基因RNA表達(dá)與蛋白表達(dá)水平的增加。采用免疫印跡技術(shù)研究N-亞硝胺類(lèi)致癌物對(duì)胃腸消化道CYP 2E1的誘導(dǎo)機(jī)制，結(jié)果證明CYP 2E1的表達(dá)量增加。腸道的上皮組織中CYP 1A1蛋白表達(dá)顯著，表明CYP 1A1基因可以被外源化合物誘導(dǎo)表達(dá)。以上結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果一致，十二指腸CYP 1A1、CYP 2E1參與外源性化合物代謝的過(guò)程，且被誘導(dǎo)表達(dá)量上升，這與本試驗(yàn)中CYP 1A1和CYP 2E1基因表達(dá)增加的結(jié)果一致。由于小腸生物轉(zhuǎn)化能使外源物質(zhì)活化為對(duì)生物體有毒的物質(zhì)，所以Sudan Ⅰ在大鼠十二指腸內(nèi)可能是由CYP 1A1、CYP 2E1代謝為苯胺，苯胺量的增多很可能使機(jī)體損傷。

Sudan Ⅰ 進(jìn)入大鼠體內(nèi)在腸道還原酶的作用下被分解，生成具有強(qiáng)烈毒性的有機(jī)化合物，CYP 1A1、CYP 2E1參與了機(jī)體代謝，誘導(dǎo)十二指腸 CYP 1A1、CYP 2E1表達(dá)升高，可能誘發(fā)腸道細(xì)胞基因的突變，進(jìn)而促進(jìn)癌癥的發(fā)生。