康 彪，高閃電，獨軍政，田占成，殷 宏，3*，胡永浩

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，甘肅蘭州 730046；3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009)

牛病毒性腹瀉-黏膜病(Bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD-MD)是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的一種家畜傳染病[1]。臨床上以發(fā)熱、腹瀉、呼吸道癥狀、出血綜合征、黏膜糜爛、白細胞減少、懷孕母牛流產(chǎn)、產(chǎn)畸形胎為主要特征[2]。該病主要發(fā)生于牛，各年齡段牛均可感染，但犢牛易感性較高。該病毒還可以感染豬、羊、鹿、駱駝等家畜，以及感染非洲水牛、大羚羊、加拿大野牛、羊駝、駱馬、普度鹿、麅羚、狍、鼷鹿、比利牛斯臆羚、叉角羚等多種偶蹄野生動物[3-6]。該病毒傳播途徑多樣，懷孕母牛發(fā)生感染經(jīng)胎盤垂直傳播給胎牛，是 BVDV 的最常見的傳染方式。此外，被污染的飼料、飲水和運輸工具以及空氣中傳染性飛沫、人工授精等都可傳播該病。若動物患病形成持續(xù)性感染并形成免疫耐受，不表現(xiàn)任何臨床癥狀，但仍然帶毒排毒，造成牛群的產(chǎn)能下降，還可能誘發(fā)其他病原感染，導致繼發(fā)感染和混合感染[7]，給養(yǎng)殖業(yè)造成很大經(jīng)濟損失，已成為危害畜牧業(yè)的主要疫病之一。

BVDV屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)。病毒粒子為含有囊膜的球型粒子，直徑約40 nm～60 nm[8]。BVDV僅有1個血清型，但不同病毒株間存在抗原多樣性，可分為3個基因型，即BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3，其中BVDV-1和BVDV-2還可以進一步分為BVDV-1a～BVDV-1u[9-11]和BVDV-2a～BVDV-2d等基因亞型[12]。BVDV基因組為單股正鏈RNA，包含一個大的開放閱讀框(ORF)，編碼一個近4000個氨基酸組成的多聚蛋白，并由細胞和病毒基因編碼的蛋白酶在翻譯時和翻譯后進行加工，生成12種成熟的蛋白質(zhì)，其中C、Erns、E1、E2等4種蛋白為病毒的結構蛋白，構成BVDV的病毒粒子，其余的N、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B等8種為病毒的非結構蛋白，在病毒的成熟和基因復制中起著關鍵作用。BVDV感染細胞必須依賴E1-E2形成二聚體，并且兩個蛋白的跨膜區(qū)中帶電氨基酸在異二聚體形成過程中起重要作用[13]。為了進一步研究E1蛋白在BVDV感染中的作用，本研究利用原核系統(tǒng)表達獲得了重組E1蛋白，并制備了兔源多克隆抗體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株、表達質(zhì)粒、細胞、菌株及實驗動物 試驗所用病毒株BVDV-AV69 VEDEVAC購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，傳代20次后保存于-80℃；原核表達載體pPROEX-Htb購自Invitrogen公司；E.coli感受態(tài)細胞BL21 (DE3)購自寶生物工程(大連)有限公司；含有BVDV-AV69 VEDEVAC毒株E1編碼基因的重組克隆載體pGEMT-E1、牛腎細胞(MDBK)均由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室保存；8周齡雌性新西蘭白兔購自中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 MEM培養(yǎng)基，購自Hyclone公司；新生犢牛血清，購自Gibco公司；TaKaRa ExTaq、內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ、膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒，購自寶生物工程(大連)有限公司；預染蛋白Marker，購自Thermo公司; 蛋白質(zhì)純化試劑盒ProBondTMPurification System，購自 Invitrogen公司；堿性磷酸酯酶(AP)標記的山羊抗兔Ig G、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔Ig G、BCIP/NBT Liquid substrate system堿性磷酸酶顯色試劑盒，均購自Sigma公司; 兔抗BVDV全病毒陽性參考血清和陰性血清，均由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室制備保存；FITC標記的山羊抗兔IgG，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與病毒增殖 常規(guī)方法培養(yǎng)傳代MDBK細胞，待細胞長滿單層后接種100 TCID50的BVDV懸液，37℃培養(yǎng)箱作用2 h，加入維持液，培養(yǎng)到病變達到80%時，反復凍融3次后，收集病毒培養(yǎng)液，置-70℃保存。

1.2.2 擴增E1基因引物的設計與合成 根據(jù)BVDV-AV69 VEDEVAC毒株E1的編碼基因序列(GenBank：KC695814，1852-2436 nt)，設計1對擴增E1基因的引物，分別為：上游引物F：5′-CATGGATCCATGGCCTCTCCCTACTGTGAGGTAG-3′; 下游引物R：5′-GACAAGCTTCTACCCTTGTGCTCCTGTTATGAGT-3′，下劃線部分分別為BamHⅠ和HindⅢ酶切位點，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 E1基因表達載體的構建 以pGEMT-E1為模板，利用F引物和R引物進行PCR擴增，反應條件為:95℃ 5 min; 95℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共30個循環(huán); 72℃ 延伸10 min，4℃終止反應。將PCR產(chǎn)物用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切膠純化后用BamHⅠ和Hind Ⅲ進行雙酶切，與同樣酶切處理的pPROEX-HTb載體用T4 DNA Ligase 于16℃連接過夜，轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞。挑取單菌落，接種于5 mL含60 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min過夜培養(yǎng)后，用引物進行菌液PCR檢測，將初步鑒定為陽性的重組菌抽提質(zhì)粒，選2個質(zhì)粒委托南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。將測序正確的陽性重組質(zhì)粒命名為pPRO-E1。

1.2.4 E1蛋白的表達與純化 將鑒定正確的重組菌接種于500 mL含60 μg/mL氨芐青霉素的LB中，培養(yǎng)至OD600nm值在0.6～0.8之間時，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，10 000 r/min離心10 min；收集菌體，以20 mL pH 7.4的PBS重懸沉淀，超聲破碎菌體，10 000 r/min離心20 min；分別收集上清液和沉淀進行SDS-PAGE。對以包涵體形式表達的重組蛋白用含8 mol/L尿素進行溶解，利用ProBondTM Purification System 對重組蛋白進行純化，用透析液(10 mmol/L Tris,pH 8.0,1 g/L Triton X-100)透析復性后SDS-PAGE鑒定。

1.2.5 重組E1蛋白的免疫印跡檢測 重組 E1蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，轉印至2塊硝酸纖維素膜上，用50 g/L脫脂乳4℃過夜封閉，分別加入兔抗BVDV陽性參考血清(1∶500)和兔陰性血清(1∶500)，37℃作用1 h，PBST洗劑3次，加入堿性磷酸酯酶(AP)標記的山羊抗兔Ig G( 1∶10 000) 37℃作用1 h，PBST洗劑3次，用BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒進行顯色。

1.2.6 重組 E1 蛋白兔源多克隆抗體的制備 取純化的 E1 蛋白與弗氏完全佐劑等比例混合制成油乳劑，免疫2只新西蘭雌性白兔。分別標記為①②，采集免疫前陰性血清，之后于背部皮下多點注射，進行第一次免疫，免疫的抗原量約100 μg。一免后20 d，采集一免后血清，以100 μg重組E1蛋白與弗氏不完全佐劑等比例制成的油乳劑，進行第2次免疫。20 d后采集二免后血清，以100 μg重組E1蛋白進行第3次免疫。末次免疫20 d后經(jīng)心臟采血，分離血清，置-20℃保存，備用。

1.2.7 兔抗E1蛋白多克隆抗體效價的測定 以純化的重組E1蛋白為包被抗原(包被濃度為0.5 μg/mL)，以免疫前的兔血清1∶100稀釋作為陰性對照血清，將①②兔抗E1蛋白多克隆血清進行1∶100～1∶12 800倍比稀釋，以1∶10 000倍稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔Ig G為酶標二抗，以TMB為底物顯色液，以免疫血清OD450 nm值/陰性對照血清OD450 nm值大于等于2為陽性判定標準，進行間接ELISA檢測，判定兔抗E1蛋白多克隆抗體的效價。

1.2.8 間接免疫熒光法(IFA)檢測抗體免疫反應性 將105個MDBK細胞分A、B兩組鋪于6孔細胞培養(yǎng)板上進行培養(yǎng)，每組設一個平行。24 h后，將500 TCID50的BVDV接種A組細胞，B組作為病毒陰性對照，48 h后用制備的多克隆抗體作為一抗(1∶200倍稀釋)，作用于A、B兩組。用1∶500倍稀釋的FITC標記山羊抗兔IgG為二抗，對兩組細胞進行免疫熒光試驗，檢測制備的多克隆抗體的反應性。

2 結果

2.1 E1基因RT-PCR擴增結果

經(jīng)PCR擴增得到的E1基因產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，在約585 bp處有1個特異性條帶，與預期產(chǎn)物大小相符(圖1)。

M.DNA標準DL 2 000；1.E1基因的PCR擴增產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000; 1.PCR products of E1 gene

圖1 E1基因PCR擴增

Fig.1 PCR amplification of the E1 gene

2.2 E1基因表達載體的構建

將E1基因擴增產(chǎn)物與載體pPROEXHTb分別進行雙酶切處理，連接后轉化E.coliBL21 (DE3)感受態(tài)細胞，對挑取單菌落進行培養(yǎng)和菌液PCR鑒定，共獲得7個陽性克隆(圖2)，測序結果表明，所選2個克隆序列完全一致，含有正確的E1基因序列，且讀碼框正確。

M.DNA標準DL 2 000；1～9.菌液PCR擴增產(chǎn)物；N.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000; 1-9.PCR products of bacterial liquids; N.Negative control

圖2 E1重組菌的PCR鑒定

Fig.2 PCR identification of the recombinant E1 bacteria

2.3 E1蛋白的誘導表達與表達形式及純化鑒定結果

選擇測序正確的重組菌，經(jīng)擴大培養(yǎng)及IPTG誘導后，超聲破碎離心，對上清和沉淀進行SDS-PAGE檢測。結果顯示，重組蛋白以包涵體形式表達，包涵體經(jīng)純化、透析得到較純的目的蛋白，其分子質(zhì)量大小約為23 ku(圖3)。

N.未誘導對照；M.蛋白分子質(zhì)量標準；1～5.誘導后4 h～8 h收樣；6.菌體超聲裂解后上清；7.菌體超聲裂解后沉淀；8.純化的E1蛋白

N.Uninduced control; M.Protein molecular weight Marker; 1-5.Induced pPRO-E1 samples for 4 h-8 h; 6.Lysate supernatant of recombinant pPRO-E1 bacteria after ultrasonication；7.Lysate precipitate of recombinant pPRO-E1 bacteria after ultrasonication; 8.Purified recombinant E1 protein

圖3 E1重組蛋白的誘導表達和純化

Fig.3 Expression and purification of the recombinant E1 protein

2.4 E1重組蛋白的免疫印跡檢測

Western blot結果表明，重組蛋白可與兔抗BVDV陽性血清發(fā)生特異性反應，而與陰性血清作用無特異條帶出現(xiàn) (圖4) 。

M.蛋白分子質(zhì)量標準； 1.純化的蛋白與陰性血清作用； 2.純化的蛋白與陽性血清作用

M.Protein molecular weight Marker; 1.E1 protein interacts with negative serum; 2.E1 protein interacts with positive serum

圖4重組表達蛋白的Western blot分析

Fig.4 Analysis of the recombinant expression protein
by Western blot

2.5 兔抗E1蛋白多克隆抗體效價的測定

ELISA試驗結果顯示 (圖5)，當血清達到1∶12 800稀釋時，①②兔抗E1蛋白多克隆抗體的OD450 nm值分別為1.468和1.576，明顯高于陰性血清的OD450 nm平均值0.399，說明多克隆抗體效價可以達到1∶12 800以上。

1.抗E1蛋白家兔血清；2.抗E1蛋白家兔血清；N.免疫前家兔血清

1.Rabbit anti-E1 sera;2.Rabbit anti-E1 sera;N.Rabbit pre-immune sera

圖5間接ELISA測定兔抗E1蛋白多克隆血清抗體的效價

Fig.5 Determination the titer of rabbit polyclonal antibodies against
E1 protein by indirect ELISA

2.6 間接免疫熒光試驗(IFA)

IFA結果顯示，在接種BVDV的MDBK細胞中(A組)可以看到明顯的熒光，未接種病毒的陰性對照MDBK細胞中(B組)未發(fā)現(xiàn)特異的熒光，表明制備的兔抗E1多克隆抗體與BVDV天然抗原具有良好的反應原性。

A.E1多克隆抗體試驗組；B.陰性對照組A.Anti-E1 polyclonal antibody group; B.Negative control group

3 討論

制備高效價的抗體，是研究基因表達及基因功能的基礎。多克隆抗體具有與多個抗原簇結合的位點，并且制備簡便，成本低廉，在免疫學上有著廣泛的使用空間[14]。本研究表達了BVDV E1蛋白，重組E1蛋白以包涵體存在，大小為23 ku，具有生物學活性。制備的重組E1多克隆抗體單一針對E1蛋白，試驗采用的兔子遺傳背景清楚，相對于BVDV感染牛制備的抗體具有更好的特異性，應用于組織細胞培養(yǎng)及生物制品中BVDV污染的檢測，結果也更為可靠。因BVDV不同毒株之間具有抗原多樣性，可能造成不同毒株之間的抗原決定簇也有一定的差異[14]。研究表明，BVDV的E2蛋白和Erns蛋白可誘生中和抗體[15-16]，而E1蛋白不能使動物產(chǎn)生中和抗體，所以我們無法用中和試驗驗證獲得的多克隆抗體的中和效價，但免疫熒光試驗證實了所獲的多克隆抗體是比較敏感的。就特異性而言，BVDV重組蛋白E1多克隆抗體可能沒有單克隆抗體好，但單克隆抗體多為針對單一的抗原決定簇，而多克隆抗體針對多個抗原決定簇，因此就實際使用來說，BVDV重組E1多克隆抗體可能與較多的毒株發(fā)生反應。本研究以原核表達的E1蛋白制備了多克隆抗體，為BVDV的檢測和E1蛋白功能研究奠定了基礎。