蔣興川，蔣秀云，李志華，程 鵬，王曉晴，干春霞，桂富榮

西花薊馬(Frankliniella occidentalis Pergande)屬纓翅目、薊馬科、花薊馬屬，是一種世界性檢疫害蟲，其個體小，易隱藏，繁殖快，食性雜，可取食約66科500多種植物，并可傳播植物病毒，現(xiàn)已成為全球范圍內(nèi)蔬菜、花卉及果樹上的重要害蟲之一[1-3]。該蟲起源于美國和加拿大的西部地區(qū)[4]，現(xiàn)已傳播至歐洲、亞洲、非洲、大洋洲、中美和南美洲等多個國家和地區(qū)[3]，我國北京、云南、浙江、山東等地區(qū)農(nóng)作物也受到西花薊馬危害[1,3]。

云南氣候類型豐富多樣，擁有北熱帶、南亞熱帶、中亞熱帶、北亞熱帶、南溫帶、中溫帶和北溫帶七個氣候帶[5]；而西花薊馬從2000年首次在昆明被發(fā)現(xiàn)至今短短十幾年，現(xiàn)已成為云南省多個氣候帶薊馬種類的優(yōu)勢種[6]。國內(nèi)學(xué)者對中國部分地理種群的西花薊馬遺傳分化進(jìn)行了研究[7-11]，而有關(guān)云南省不同氣候帶西花薊馬遺傳多樣性的影響未見報道。

簡單序列重復(fù)區(qū)間標(biāo)記(Inter-simple sequence repeat, ISSR)具有操作簡單靈敏、模板需求少、穩(wěn)定性較高、成本低等優(yōu)點，成為物種遺傳多樣性常用的檢測方法[12]；目前已被廣泛應(yīng)用于植物、動物、微生物等物種的遺傳多樣性分析、資源鑒定與分類、親緣關(guān)系、系統(tǒng)發(fā)育和品種資源鑒定相關(guān)研究領(lǐng)域[12-15]。本研究擬利用ISSR技術(shù)研究云南省不同氣候帶西花薊馬的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性，可為解析云南省西花薊馬的入侵來源、擴(kuò)散方式及對其有效防治提供重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

在云南省的七個氣候帶中，前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)海拔較高的北溫帶和中溫帶辣椒植株上未見西花薊馬危害。因此本研究于2011年～2012年采集其余五個氣候帶(北熱帶、南亞熱帶、中亞熱帶、北亞熱帶和南溫帶)的45個地區(qū)辣椒植株上西花薊馬樣本(表1，圖1)，按照劉寧等[16]的方法進(jìn)行種類鑒定后，將西花薊馬浸入到85%的酒精中，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試西花薊馬樣本信息

圖1 云南省西花薊馬的45個采樣點分布圖
備注：數(shù)字代表的種群見表1，下同。

1.2 ISSR-PCR方法

ISSR引物及退火溫度參照實驗室前期研究結(jié)果[17]，委托上海生工公司合成(多態(tài)性引物信息見表2)。西花薊馬基因組DNA的提取及ISSR-PCR反應(yīng)條件參照本實驗室前期研究結(jié)果[18]，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，使用Bio-Rad成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理方法參照柳青等[15]的方法。在遺傳相似性系數(shù)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用NTSYS-pc 軟件包中的DCENTER和EIGEN程序進(jìn)行主坐標(biāo)分析(Principal coordinate analysis，PCOA)，測定各樣本原始數(shù)據(jù)在系統(tǒng)樹構(gòu)建中的貢獻(xiàn)大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 西花薊馬ISSR-PCR擴(kuò)增多態(tài)性分析

12條ISSR引物在45個西花薊馬采樣點中共擴(kuò)增出93個條帶，其中多態(tài)性條帶60個，占總條帶數(shù)的64.52%，說明所檢測的樣品具有較高的遺傳多樣性。60條多態(tài)性條帶中有39條由含(CT)n、 (AG)n和(GA)n等為主的二堿基重復(fù)系列引物擴(kuò)增產(chǎn)生，占總多態(tài)性條帶數(shù)的65.00%；有11條帶是由含(ATG)n和(ATG)n三堿基重復(fù)系列引物擴(kuò)增產(chǎn)生，占總數(shù)的18.33%(表2)。

表2 ISSR-PCR引物擴(kuò)增結(jié)果

12條ISSR 引物的多態(tài)信息量(PIC)的范圍在0.129(UBC879)到0.59(UBC864)之間，平均PIC值為0.36；其標(biāo)記指數(shù)(MI)在0.647(UBC879)到6.432(UBC864)之間，平均MI值為2.97(表2)。不同引物間擴(kuò)增條帶數(shù)也存在著差異：在12條引物中，引物UBC864擴(kuò)增出條帶數(shù)最多，為11條；而引物UBC879擴(kuò)增出條帶數(shù)最少，僅為5條；不同引物間多態(tài)位點百分率也存在著差異，引物UBC835的多態(tài)位點百分率均為100.00%，而引物UBC879的多態(tài)位點百分率僅為20.00%(表2)。

2.2 西花薊馬種群的遺傳分化分析

西花薊馬種群間的遺傳距離見表3。由表可知：遺傳距離介于0.000-0.318之間，其中種群KMAN(昆明市安寧縣)和種群KMFM(昆明市富民縣)的遺傳距離最小(0.000)，而種群LJHP(麗江市華坪縣)和種群HHYY(紅河州元陽縣)之間遺傳距離最大(0.318)。說明入侵云南省的西花薊馬長期在不同氣候環(huán)境的作用下，發(fā)生了一定程度的遺傳分化，具有豐富的遺傳多樣性。

表3云南省西花薊馬45個種群間遺傳距離

2.3 西花薊馬種群的聚類分析

云南省45個采樣點西花薊馬系統(tǒng)聚類結(jié)果見圖2。所有種群可分為五大類群，第一大類包括KMPL、KMCG、KMAN、KMFM、KMSM等10個種群，均屬于北亞熱帶；第二大類均屬于中亞熱帶，依次為KMJN、YXES、WSMG、WSWS、DLBC等10個種群；第三大類僅有HHYY、YXYJ、HHJP、BNML、BNJH這5個種群，除了HHYY屬于中亞熱帶，其余4個種群均屬于北熱帶；第四大類包含的西花薊馬種群數(shù)最多(13個)，分別是CXCX、CXNH、CXYA、BSLY這4個北亞熱帶種群，以及CXYM、LJHP、HHSP、PENE等9個南亞熱帶種群；第五大類均屬于南溫帶，分別為LJYS、LJGC、LJNL、DLHQ、ZTZY、ZTLD、QJHZ。

圖2 45個采樣點西花薊馬的UPGMA聚類圖

2.4 西花薊馬ISSR-PCR主坐標(biāo)分析(PCOA)

應(yīng)用NTSYSpc 2.0軟件對西花薊馬ISSR-PCR結(jié)果進(jìn)行兩維空間主坐標(biāo)分析，結(jié)果表明：45個采樣點的西花薊馬分為5大類，其中北亞熱帶的CXCX等4個種群以及南亞熱帶的CXYM等8個種群聚為一類；北亞熱帶的KMPL等10個種群聚為一類；北熱帶的YXYJ等4個種群聚為一類；中亞熱帶的KMJN等9個種群聚為一類；南溫帶的LJYS等7個種群聚為一類(圖3)?？梢?，PCOA的分析結(jié)果與UPGMA聚類結(jié)果在整體上趨于一致(圖2-3)。然而也有少部分種群沒有歸到PCOA分析的任何類群，例如HHYY、LJHP、DLBC等地。因此，綜合分析系統(tǒng)聚類結(jié)果和PCOA主坐標(biāo)分析結(jié)果，才能準(zhǔn)確解析西花薊馬不同地理種群的遺傳差異。

圖3 45個樣點西花薊馬的主坐標(biāo)分析

3 討論與結(jié)論

簡單序列重復(fù)區(qū)間標(biāo)記 (ISSR)技術(shù)在遺傳學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用[12]。遺傳變異是物種適應(yīng)環(huán)境變化的必要條件，遺傳多樣性是檢測物種的生存適應(yīng)能力、進(jìn)化潛力的重要指標(biāo)，物種的遺傳多樣性越豐富，其對環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強[15]。多態(tài)信息量 (PIC)、多態(tài)位點百分率(PPB)、標(biāo)記指數(shù)(MI) 是衡量遺傳多樣性常用的指標(biāo)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，云南省西花薊馬種群的PIC、PPB、MI值分別為0.36、64.52%、2.97，表明云南省西花薊馬種群遺傳結(jié)構(gòu)復(fù)雜、遺傳異質(zhì)性較高，具有豐富的遺傳多樣性，在不同氣候帶環(huán)境表現(xiàn)出很強的適應(yīng)性。

種群間的遺傳距離可揭示種群遺傳分化的程度[14]。本研究發(fā)現(xiàn)45個西花薊馬種群的遺傳距離系數(shù)介于0.000—0.318之間；UPGMA聚類與PCOA分析結(jié)果基本一致，均將云南省不同西花薊馬種群分為5大類，且相同氣候帶的西花薊馬種群大多聚為一類。這可能是由于云南省不同氣候帶的環(huán)境因素差異較大，對西花薊馬的生長發(fā)育及遺傳變異產(chǎn)生了影響。Yang等[8]研究表明我國不同地區(qū)西花薊馬的遺傳多樣性存在著差異，且大理、保山及昆明的遺傳多樣性高于其他地區(qū)；張桂芬等[10]采用mtDNA標(biāo)記技術(shù)，對我國13個省(市)不同地理種群西花薊馬的遺傳結(jié)構(gòu)和分化進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)我國西花薊馬各地理種群之間可能已發(fā)生不同程度的遺傳分化；這些研究與本研究結(jié)果一致。而沈榮登等[7,9]采用mtDNA標(biāo)記技術(shù)研究了云南部分地區(qū)西花薊馬的遺傳結(jié)構(gòu)及其分化，結(jié)果表明各地理種群間的遺傳分化程度很低，種群間存在基因交流；與本研究結(jié)果存在著差異，這可能是由于供試種群數(shù)量及分析方法不同導(dǎo)致的。

本研究利用ISSR技術(shù)對云南省不同氣候帶西花薊馬的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，明確了其遺傳多樣性水平，為揭示西花薊馬不同地理種群間相互進(jìn)化關(guān)系、解析云南省西花薊馬的擴(kuò)散方式及對其有效防治提供重要的理論基礎(chǔ)。