胡燕梅，向鵬飛，李凱鵬

（1.江漢大學(xué) 期刊社，湖北 武漢 430056；2.武漢生物工程學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430415）

麗格海棠（begonia×elatior）為秋海棠科秋海棠屬多年生草本花卉，是球根秋海棠和野生秋海棠的雜交品系。麗格海棠株形豐滿，花形和玫瑰相似，故又名玫瑰海棠。其花色豐富，花朵碩大，色彩艷麗。我國20世紀(jì)90年代從國外引進(jìn)該品種，近年來在國內(nèi)發(fā)展很快，目前是國際花卉市場上非常暢銷的盆花之一［1］。麗格海棠一般不形成種子，多采用扦插繁殖。其扦插繁殖主要采用葉插和莖插為主，但是扦插過程中很容易爛根，且繁殖速度較慢，不能滿足市場需要［2-3］。植物組織培養(yǎng)技術(shù)能夠快速繁殖優(yōu)質(zhì)種苗，在一定程度上可以滿足市場需求，目前已廣泛應(yīng)用于觀賞植物的種苗生產(chǎn)［4-7］。本試驗以麗格海棠的幼嫩葉片為材料，進(jìn)行體外再生培養(yǎng)，優(yōu)化麗格海棠快速繁殖體系，以期為其工廠化育苗打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 無菌材料的獲得

麗格海棠采購于武漢林業(yè)有限責(zé)任公司。選取生長健壯的麗格海棠作為母株材料，摘取植株上已平展的幼葉，用含少量洗衣粉的清水洗約2 min，洗凈后流水沖洗30 min，置超凈工作臺上酒精處理30 s，然后放入0.1%的升汞溶液中浸泡消毒8 min，再用無菌水沖洗5～6次后取出。用無菌濾紙將材料吸干，用解剖刀先切去葉片的邊緣后將葉片切成1 cm2的小片，每片最好帶有葉脈，然后通過無菌操作進(jìn)行接種，接種材料的培養(yǎng)條件為：溫度23～27℃，光照度1 000～2 000 lx，光照周期12～14 h/d。

1.2 不定芽的誘導(dǎo)

1.2.1 基本培養(yǎng)基對葉片不定芽分化的影響 將消毒好的外植體葉片接種于基本培養(yǎng)基MS、N6和B5中，每種基本培養(yǎng)基中加 1.0 mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30 g/L 蔗糖 +8g/L 瓊脂，pH5.8。每個處理接種18個外植體。培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計有效接種數(shù)、分化不定芽的有效接種數(shù)、分化的不定芽數(shù)、有效不定芽數(shù)（葉柄長度和葉片直徑超過1 cm的不定芽），并計算不定芽分化率和不定芽分化系數(shù)。

有效接種數(shù)：接種后沒有污染的外植體葉片數(shù)；

分化率＝（分化不定芽的外植體葉片數(shù)/有效接種數(shù)）×100%；

不定芽分化系數(shù)＝分化的不定芽數(shù)/有效接種數(shù)；

有效不定芽分化系數(shù)＝有效不定芽數(shù)/有效接種數(shù)。

1.2.2 6-BA與兩種生長素對葉片不定芽分化的影響 以MS+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂為基本培養(yǎng)基，6-BA設(shè)5個梯度，分別為：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L，NAA和IBA濃度為0.1 mg/L。將消毒好的外植體葉片接種到這10組培養(yǎng)基中，每個處理接種18個外植體。

后續(xù)試驗又以細(xì)胞分裂素6-BA濃度1.0 mg/L為基礎(chǔ)，生長素IBA和NAA設(shè)3個梯度，分別為：0.1、0.2、0.3 mg/L，檢測兩種生長素不同的3個濃度對不定芽分化的影響。

培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計有效接種數(shù)、分化不定芽的有效接種葉片數(shù)、分化的不定芽數(shù)、有效不定芽數(shù)，并計算不定芽分化率和不定芽分化系數(shù)。

1.2.3 培養(yǎng)基介質(zhì)對不定芽芽團(tuán)增殖的影響 1.2.2培養(yǎng)過程中有大量不定芽芽團(tuán)形成，在實際生產(chǎn)中這些芽團(tuán)由于不定芽過于密集而不能單獨作為種苗加以利用而被廢棄，增加了生產(chǎn)成本。本試驗中將直徑約1 cm的不定芽芽團(tuán)接入不同培養(yǎng)基的培養(yǎng)介質(zhì)中，以探討不定芽芽團(tuán)繼續(xù)生長的效果。

以MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖為培養(yǎng)基，設(shè)計不同培養(yǎng)介質(zhì)為：濾紙（2層）、紗布（4層）、棉花（厚度0.5 cm）、液體培養(yǎng)基，以8 g/L瓊脂作為對照并記為CK。選取1.2.2中直徑約1 cm的芽團(tuán)作為外植體進(jìn)行接種，以檢測5種介質(zhì)對芽團(tuán)后期長勢的影響，每個處理接種10個外植體，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計芽團(tuán)直徑、有效芽增殖數(shù)，計算芽團(tuán)增殖倍數(shù)和有效芽增殖系數(shù)。

芽團(tuán)增殖倍數(shù)=45 d后芽團(tuán)直徑/接種前芽團(tuán)直徑；

有效芽增殖系數(shù)=有效芽增殖數(shù)/接種的芽團(tuán)數(shù)。

1.2.4 蔗糖對不定芽芽團(tuán)增殖的影響 選取1.2.2中直徑約1 cm的芽團(tuán)作為外植體，分別接種到蔗糖濃度為10、15、20、30、40 g/L的培養(yǎng)基中，以檢測不同濃度蔗糖對不定芽芽團(tuán)生長的影響。每個處理接種10個外植體，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計芽團(tuán)直徑、有效芽增殖數(shù)，計算芽團(tuán)增殖倍數(shù)和有效芽增殖系數(shù)。

1.3 不定根的誘導(dǎo)

1.3.1 IBA和NAA分別對不定根誘導(dǎo)的影響 以1/2 MS+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂為基本培養(yǎng)基，選取1.2中長勢健壯的不定芽為接種材料，分別接種于IBA和NAA不同濃度的生根培養(yǎng)基中。每個處理接種18個不定芽，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計分化不定根的材料數(shù)、不定根的誘導(dǎo)總數(shù)，計算生根率和生根系數(shù)。

生根率＝（分化不定根的材料數(shù)/有效接種數(shù)）×100%；

生根系數(shù)＝不定根的誘導(dǎo)總數(shù)/有效接種數(shù)。

1.3.2 活性炭對不定根誘導(dǎo)的影響 以1/2 MS+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂為生根培養(yǎng)基。選取1.2中所獲得的長勢健壯的不定芽為外植體，分別接種于活性炭（AC）不同濃度的生根培養(yǎng)基中。每個處理接種18個外植體，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計結(jié)果并計算生根率和生根系數(shù)。

1.3.3 PP333對不定根誘導(dǎo)的影響 以 1/2 MS+0.1mg/L NAA+30g/L 蔗糖+8 g/L 瓊脂為基本生根培養(yǎng)基。選取1.2中所獲得的長勢健壯的不定芽為外植體，分別接種于多效矬（PP333）不同濃度的生根培養(yǎng)基中。每個處理接種18個外植體，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計結(jié)果并計算生根率和生根系數(shù)。

1.4 試管苗煉苗移栽

選取長勢健壯并且均勻一致的單芽試管苗，松動封口膜3 d后打開封口膜，5 d后用無菌水洗凈根部培養(yǎng)基，分別移栽于煉苗基質(zhì)中。3種煉苗基質(zhì)成分為：Ⅰ號基質(zhì)為泥炭土∶珍珠巖=5∶2；Ⅱ號基質(zhì)為泥炭土∶珍珠巖∶鋸末 =3∶1∶1；Ⅲ號基質(zhì)為泥炭土∶鋸末=1∶1。

3種煉苗基質(zhì)均經(jīng)過高溫滅菌，每種處理移栽10株試管苗，隔天上午噴水。煉苗條件為：溫度23～27 ℃，光照度1 000～2 000 lx，光照周期12～14 h/d。

定期觀察，統(tǒng)計結(jié)果，計算成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不定芽的誘導(dǎo)

2.1.1 基本培養(yǎng)基對葉片不定芽分化的影響 幼嫩葉片在3種培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d后少量葉片的切口處變厚，有翠綠色芽點出現(xiàn)。繼續(xù)培養(yǎng)葉片邊緣的芽點形成明顯小芽，后期更多葉片上直接分化出大量不定芽（圖1）。培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計分化率及分化系數(shù)，結(jié)果見表1。

圖1 外植體葉片上分化不定芽Fig.1 Adventitious bud differentiation on explant leaves

表1 基本培養(yǎng)基對葉片不定芽分化的影響Tab.1 Effects of basic mediums on adventitious bud differentiation of leaves

從表1可以看出MS基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)葉片分化不定芽的效果明顯優(yōu)于B5和N6，其分化率達(dá)到100%，分化系數(shù)達(dá)到了10.8，且有效芽分化系數(shù)較高，達(dá)到了4.6。分化出的新芽葉片長勢良好，葉片嫩綠肥大，葉柄長且粗。N6培養(yǎng)基的分化率為72.9%，分化系數(shù)達(dá)到8.7，且有效芽數(shù)較少，有效芽分化系數(shù)僅1.5，其不定芽長勢也不理想，葉柄細(xì)長、葉片較小。B5培養(yǎng)基在前15 d長勢超過了MS和N6，但是其不定芽的葉柄粗短，不定芽數(shù)量多而密集成簇，且在培養(yǎng)后期葉片開始枯黃。綜上所述，本試驗選擇MS為適宜基本培養(yǎng)基。

2.1.2 6-BA與兩種生長素對麗格海棠葉片不定芽分化的影響 將麗格海棠的幼嫩葉片切塊接種到不同濃度6-BA和兩種生長素NAA及IBA的培養(yǎng)基上生長培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計試驗結(jié)果見表2和表3。

表2 不同濃度6-BA與兩種生長素組合對不定芽分化的影響Tab.2 Effects of combination of 6-BA with different concentrations and two auxins on adventitious bud differentiation

表3 6-BA與兩種不同濃度生長素組合對不定芽分化的影響Tab.3 Effects of combination of 6-BA and two auxins with different concentrations on adventitious bud differentiation

從表2可以看出6-BA濃度相同時NAA處理在分化率和分化系數(shù)兩個指標(biāo)上均較IBA處理效果更好，表明生長素NAA更適合于麗格海棠葉片分化出不定芽。但在NAA處理上，隨著6-BA的濃度由0.5 mg/L增加到2.5 mg/L時，分化率和分化系數(shù)均出現(xiàn)了先上升后下降的趨勢，其中1.0mg/L的6-BA處理效果最好，分化率為100%，分化系數(shù)為10.7，有效芽分化系數(shù)達(dá)到4.4。6-BA濃度較低時分化出的新芽長勢較正常，新芽葉片寬大，葉柄長，后期隨著6-BA濃度升至2.0 mg/L時有效芽分化系數(shù)為0，分化出的新芽長勢較差，葉柄短、葉片小，新芽簇生成團(tuán)狀（圖2），很多無法進(jìn)行后期繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)。所以選擇1.0 mg/L 6-BA為最適細(xì)胞分裂素濃度。

圖2 簇狀的不定芽芽團(tuán)Fig.2 Cluster of adventitious buds

從表3可以看出培養(yǎng)基中只添加細(xì)胞分裂素6-BA而不加生長素時葉片均枯死，表明生長素對于麗格海棠葉片誘導(dǎo)不定芽起著重要作用，即沒有生長素會導(dǎo)致葉片直接枯死。NAA和IBA為0.1 mg/L時，不定芽的葉柄粗短，平均長度在0.5 cm左右，葉片較小，平均大小只有0.7 cm2。隨著IBA的濃度由0.1 mg/L增加到0.2 mg/L時，IBA的分化率由82.6%達(dá)到了84.3%，分化系數(shù)由4.7達(dá)到了8.2。但NAA處理組的分化率均達(dá)到了100%，分化系數(shù)最高達(dá)到11.8，明顯優(yōu)于IBA。但當(dāng)NAA和IBA為0.3 mg/L時，雖有大量不定芽分化，但是不定芽生長成球狀，幾乎無葉柄的生成，葉片呈尖三角形狀，而與正常圓形葉片差異較大（圖2），說明高濃度的生長素雖能促進(jìn)不定芽分化，但能獲得的有效芽卻很少。綜上所述：生長素的種類以NAA為好，濃度以0.2 mg/L適宜。

2.1.3 培養(yǎng)基介質(zhì)對不定芽芽團(tuán)生長的影響 將不定芽芽團(tuán)接種到不同介質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其對不定芽芽團(tuán)吸收營養(yǎng)的快慢和生長程度影響各不相同。培養(yǎng)第15天時無介質(zhì)的培養(yǎng)基即液體培養(yǎng)基上芽團(tuán)最先生長，體積膨大，并伴隨部分葉片開始張開成圓形，有葉柄生成。后期培養(yǎng)棉花、紗布為介質(zhì)的培養(yǎng)基上也出現(xiàn)以上現(xiàn)象，瓊脂和濾紙的生長效果相對較差。45 d后的生長情況統(tǒng)計見表4。

表4 培養(yǎng)介質(zhì)對不定芽芽團(tuán)生長的影響Tab.4 Effects of mediums on growth of adventitious buds

由表4可知，接種的不定芽芽團(tuán)培養(yǎng)45 d后體積均有較大增加。其中液體培養(yǎng)基芽團(tuán)增殖倍數(shù)最大，達(dá)到5.6倍，有效芽增殖系數(shù)達(dá)到8.6。表明液體培養(yǎng)基不加任何介質(zhì)更適于不定芽芽團(tuán)生長獲得有效芽，能為后期生產(chǎn)提供更多芽苗，且成本更低廉，建議生產(chǎn)中若出現(xiàn)了不定芽芽團(tuán)，可以以液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)以獲得更多有效芽。

2.1.4 蔗糖對不定芽芽團(tuán)生長的影響 將不定芽芽團(tuán)接種到不同蔗糖濃度的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d后，20 g/L蔗糖處理組最先出現(xiàn)明顯的體積膨大，葉柄增長，葉片變寬大。30 d后其他處理也開始有明顯的體積膨大。45 d后統(tǒng)計結(jié)果（見表5）。

表5 蔗糖對不定芽芽團(tuán)生長影響Tab.5 Effects of sucrose on growth of adventitious buds

從表5可知，不定芽芽團(tuán)在蔗糖濃度為40 g/L時芽團(tuán)的增殖效果最好，增殖倍數(shù)達(dá)到6.2，但有效芽增殖系數(shù)卻僅有3.6，可能是蔗糖濃度過高，營養(yǎng)過于豐富，利于整個芽團(tuán)生長而不利于單個有效芽抽出。而低濃度的蔗糖培養(yǎng)基上芽團(tuán)雖有生長，但均不及30 g/L蔗糖處理組的不定芽芽團(tuán)的增殖倍數(shù)及有效芽增殖系數(shù)。

2.2 生根的誘導(dǎo)

2.2.1 IBA和NAA分別對不定根誘導(dǎo)的影響 將約2 cm高的健壯芽接到生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，20 d后部分芽有少量根萌發(fā)，后期大量不定根生長的同時大量芽也長勢旺盛，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計生根情況（見表6）。

表6 生長素對不定根誘導(dǎo)的影響Tab.6 Effects of auxins on inducing of adventitious roots

從表6結(jié)果可以看出培養(yǎng)基中不加生長素，生根率為0，且芽的長勢較差。但加入生長素后，生根率普遍提高，表明麗格海棠自我生根能力較差。在NAA與IBA組合中，當(dāng)NAA濃度相同時，隨著IBA濃度增加，不定根的生長情況越差；整體來說以NAA濃度為0.1 mg/L時效果最佳，尤其在單獨添加0.1 mg/L NAA的處理中，其生根率高達(dá)100%，生根系數(shù)也達(dá)到8.6，而且芽的長勢也非常旺盛?？梢妰煞N生長素使用中，NAA效果明顯好于IBA。

2.2.2 活性炭對麗格海棠生根的影響 將不定芽接種到不同濃度活性炭的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，定期觀察。對照組即不添加活性炭的處理組不定芽有大量根出現(xiàn)，且芽長勢旺盛。培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計生根情況（見表7）。

表7 活性炭對不定根誘導(dǎo)的影響Tab.7 Effects of activated carbon on inducing of adventitious roots

從表7中可以看出沒有加入活性炭的對照組的生根率和生根系數(shù)均最好，表明活性炭對不定根的誘導(dǎo)無促進(jìn)作用。由于光可誘發(fā)培養(yǎng)基中植物激素的降解，而活性炭的添加削弱了試管苗基部的光照強度［8］，所以活性炭提供的暗環(huán)境可保證植物生長所需的調(diào)節(jié)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與活性。但同時活性炭可能對激素有吸附作用，所以高濃度的活性炭會影響試管苗對植物激素的利用［9］。本試驗結(jié)果顯示活性炭添加對不定根生長不僅無促進(jìn)作用，反而有抑制作用，說明其對促進(jìn)不定根形成的生長素NAA有較強的吸附作用。

2.2.3 PP333對不定根誘導(dǎo)的影響 將不定芽接到含有不同濃度PP333的不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計生根情況（見表8）。

表8 PP333對不定根誘導(dǎo)的影響Tab.8 Effects of PP333on inducing of adventitious roots

從表8中可以看出0.1 mg/L PP333處理組不定芽的生根率和生根系數(shù)均和對照沒有明顯差異，但從長勢來看該處理組的試管苗根變粗，小苗粗壯，說明PP333有利于麗格海棠試管苗的整體長勢，可以為后期的煉苗移栽提供較好的基礎(chǔ)材料來源。這與呂文濤等［10］的研究結(jié)果一致。

2.3 試管苗煉苗移栽

麗格海棠試管苗分別移栽入3種煉苗基質(zhì)中生長，定期觀察，統(tǒng)計成活率（見表9）。

表9 試管苗的成活率Tab.9 Survival rate of test tube seedlings

從表9可以看出Ⅰ號基質(zhì)處理的成活率最高，所以泥炭土與珍珠巖比例為5∶2時適宜作為試管苗移栽的基質(zhì)。且從表中可以看出，第5天到第10天小苗的成活率普遍下降很快，而過了這個時期又趨于平緩。說明移栽苗的存活能力在5～10 d有一個臨界期，跨越這個臨界期后試管苗存活的概率增加，這與賈清華等［11］的研究結(jié)果一致。

3 討論

由于麗格海棠在自然界的扦插繁殖主要采用成熟葉片進(jìn)行，也就是說葉片是其自然繁殖的主要器官，所以在進(jìn)行麗格海棠的離體培養(yǎng)時首選外植體部位為其幼嫩葉片。

植物快繁過程中培養(yǎng)物的增殖方式有多種，其中常見的有叢生芽增殖方式［12］、不定芽增殖方式［13］、原球莖增殖方式［14］和愈傷組織增殖方式［15］，而麗格海棠的葉片主要是不定芽增殖方式，即從葉片上直接分化出大量的不定芽，繞過了愈傷組織階段，這樣對快速繁殖體系的建立可以節(jié)約大量時間。

本試驗結(jié)果表明不同的基本培養(yǎng)基在不同的時間段會有不同的試驗效果，在前15 d，B5培養(yǎng)基較MS和N6能夠使葉片更快分化不定芽，但是到15 d后B5培養(yǎng)基中的試驗苗普遍出現(xiàn)了枯萎的現(xiàn)象，其中原因還有待研究。MS培養(yǎng)基中的不定芽生長健康，葉柄、葉片比N6培養(yǎng)基中的不定芽更加粗壯和茂盛，則在本試驗中選擇MS為適宜基本培養(yǎng)基。

李玲［16］采用0.1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 激素組合，在此條件下，不定芽的莖生長較快，但較細(xì)長，存在失綠的現(xiàn)象。采用1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA時，其莖生長粗壯，30 d后開始展出綠色小葉，45 d形成小植株體?？梢娫鲋仇B(yǎng)基中激素配比以1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA比較適宜。這與本試驗結(jié)果一致，培養(yǎng)基中要有適當(dāng)?shù)纳L素存在和細(xì)胞分裂素起協(xié)同效應(yīng)才能更好地刺激不定芽的分化。王海朋等［17］發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中無生長素時大量的麗格海棠‘宣言’品種的外植體葉片枯黃和死亡，與本試驗中NAA和IBA為0 mg/L時所有葉片均枯死的試驗現(xiàn)象是一致的，證明生長素對葉片的生長有重要作用。隨著生長素濃度的增加分化系數(shù)也增加，當(dāng)生長素的濃度達(dá)到0.3 mg/L時，分化的不定芽成球狀，幾乎無莖和葉柄出現(xiàn)，或者葉柄很短?？梢娗捌谏L素的濃度篩選設(shè)計在0.1～0.3 mg/L是可行的。李曉東等［18］發(fā)現(xiàn)麗格海棠葉片進(jìn)行不定芽增殖的同時伴有根系生成，說明麗格海棠含有一定量的內(nèi)源生長素，而在本試驗過程中沒有發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，可能是由于試驗材料所選麗格海棠品種不同所致。芽團(tuán)生長試驗表明直接將芽團(tuán)接入液體培養(yǎng)基中利于芽團(tuán)有效芽的生長，為生產(chǎn)中大量不定芽的后續(xù)利用提供了可能，否則不定芽芽團(tuán)將有可能直接廢棄，增加了生產(chǎn)成本。

麗格海棠組培苗對生根培養(yǎng)基中的激素質(zhì)量濃度要求也較為嚴(yán)格，最適宜的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1 mg/L NAA，其生根率高達(dá)100%。即在培養(yǎng)基中單獨加入NAA而不加6-BA也能很好地誘導(dǎo)不定根的形成。但并非NAA的使用濃度越高效果就越好，即需要適宜濃度。潘梅等［19］的研究表明根數(shù)和生根率同激素質(zhì)量濃度呈現(xiàn)不均勻的變化，根的粗壯程度與激素質(zhì)量濃度的增加并無規(guī)律性的變化，當(dāng)激素質(zhì)量濃度超過一定范圍，生根數(shù)目相對較少，根的分化效果也不理想，而且有大量愈傷組織形成。這一結(jié)果與本試驗結(jié)果有相似之處，說明NAA適宜濃度的選擇對生根效果的影響是很大的。培養(yǎng)基中添加活性炭不利于生根，但多效矬處理卻生根效果明顯，且芽苗更粗壯，利于后期煉苗移栽。